響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助法提取昆侖雪菊色素的工藝研究

徐璐+汪濤+郭巧生+李維林

[摘要] 以昆侖雪菊干燥頭狀花序為試驗材料，利用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取昆侖雪菊色素的條件，分別考察提取溫度、超聲時間、液料比及溶劑濃度對提取效率的影響。實驗表明昆侖雪菊色素以黃酮類成分為主，色素提取液在紫外-可見光區(qū)最大吸收波長為380 nm。在單因素實驗基礎(chǔ)上，進行4因素3水平的響應(yīng)面分析實驗，優(yōu)化條件為提取溫度70 ℃、超聲時間60 min、液料比32.05∶1 mL·g^-1、溶劑濃度為72.25%的乙醇，在此條件下昆侖雪菊色素提取液的吸光度為0.936，與模型預(yù)測值接近，方程擬合良好，適于對昆侖雪菊色素提取工藝進行回歸分析和參數(shù)優(yōu)化。

[關(guān)鍵詞] 昆侖雪菊;超聲波;響應(yīng)面設(shè)計法;色素

[收稿日期] 2014-09-01

[通信作者] 郭巧生，Tel/Fax： （025）84395980，E-mail：gqs@njau.edu.cn;李維林，Tel/Fax：（025）84347002，E-mail：lwlcnb@mail.cnbg.net

雙色金雞菊Coreopsis tinctoria Nutt.屬于菊科金雞菊屬，原產(chǎn)于美國中西部地區(qū)，目前在我國新疆部分地區(qū)大面積栽培，干燥頭狀花序入藥，稱為昆侖雪菊，沖泡后茶湯呈絳紅色，維吾爾語“古麗恰爾”[1-3]。昆侖雪菊具“破血疏肝，解疔散毒”，作為茶飲亦可清熱解毒、降脂降壓[4] 。昆侖雪菊舌狀花瓣鮮艷肥厚，管狀花瓣色深適合提取無毒副作用，甚至具有藥理保健功效的天然色素[5-7]。

響應(yīng)面法自20世紀70年代應(yīng)用于食品藥品工業(yè)以來[8]，常被應(yīng)用于確定食品藥品中各成分作用和各成分所占比例、利用響應(yīng)面設(shè)計法（RSM）優(yōu)化反應(yīng)條件[9]，響應(yīng)面設(shè)計法是可靠的實驗設(shè)計以及分析方法，因此本實驗采用該方法優(yōu)化昆侖雪菊色素提取工藝，為將來昆侖雪菊深加工提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

昆侖雪菊采自新疆維吾爾自治區(qū)昌吉市，經(jīng)南京農(nóng)業(yè)大學郭巧生教授鑒定為菊科植物兩色金雞菊C. tinctoria 的頭狀花序。95%乙醇（化學純）購于南京化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FZ-102型植物粉碎機（武漢格萊莫檢測設(shè)備有限公司）;DK-S26型電熱恒溫水浴鍋（上海精密實驗設(shè)備有限公司）;KQ250B型超聲儀（昆山市超聲儀器公司）;FA1104（1/1萬，上海精科天平）;756CRT型紫外-可見分光光度計（上海精密科學儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 超聲波輔助提取昆侖雪菊色素工藝流程 昆侖雪菊干燥頭狀花序，粉碎，過60目篩，超聲波輔助浸提，抽濾即得色素樣品。

1.3.2 色素提取液吸收波長及稀釋倍數(shù)的確定 天然色素提取物中存在大量非色素成分，中國食品添加劑標準規(guī)定用吸光度表示[10]。取0.25 g干燥雪菊藥材粉末，30 mL 70%乙醇超聲提取45 min后抽濾，取1 mL提取液分別稀釋至0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6單位濃度，在300～600 nm波段掃描確定色素提取液的最大吸收波長[11]。

1.3.3 超聲輔助提取法與傳統(tǒng)浸提法提取效果的比較 準確稱取0.10 g昆侖雪菊粉末，以70%乙醇為提取溶劑，分別采用傳統(tǒng)浸提法和超聲輔助法進行色素提取?？疾炖鲅┚赵诓煌崛》椒l件下色素提取效率的差異[12]。

1.3.4 超聲輔助提取昆侖雪菊色素單因素試驗 準確稱取0.10 g昆侖雪菊粉末，以70%乙醇為提取溶劑。考察不同超聲波水浴溫度（40，50，60，70，80 ℃）、超聲波處理時間（15，30，45，60，75 min）、液料比（20∶1，30∶1，40∶1，50∶1，60∶1 mL·g^-1）及浸提劑濃度（50%，60%，70%， 80%，95%）對提取效率的影響。

1.3.5 響應(yīng)面優(yōu)化超聲輔助提取昆侖雪菊色素試驗 在單因素實驗基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法中Box-Behnken的中心組合試驗設(shè)計原理，以吸光度為響應(yīng)值，通過響應(yīng)曲面分析進行提取條件的優(yōu)化，并運用Design-Expert 8.0 軟件設(shè)計并分析得到最優(yōu)提取條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 昆侖雪菊色素提取液波段掃描圖

采用超聲波輔助提取法，在70 ℃、液料比30∶1 mL·g^-1的條件下，昆侖雪菊色素提取液在380 nm處有最大吸收峰，同時采用傳統(tǒng)浸提法提取昆侖雪菊色素提取液在380 nm處也有顯著吸收峰，因此380 nm為雪菊色素提取液的最大吸收波長（圖1），本實驗在測定提取液吸光度時，應(yīng)在此波長條件下進行。單位濃度為0.2時的讀數(shù)在0～1，此稀釋倍數(shù)最佳。穩(wěn)定性實驗表明（2，4，8，16，24，48 h），雪菊色素提取液穩(wěn)定性良好，RSD 1.1%。

2.2 超聲輔助提取法與傳統(tǒng)浸提法提取效果的比較

超聲輔助法提取效果在速率和效率都優(yōu)于傳統(tǒng)浸提法，隨著提取時間的增加吸光度下降（圖2），可能由于提取時間過長造成溶液中雜質(zhì)含量增加，最終影響提取效率。

2.3 超聲輔助提取昆侖雪菊色素單因素試驗

2.3.1 提取溫度對提取效果的影響 按1.3.4項下方法，選擇提取溫度分別為40，50，60，70，80 ℃進行比較。總體分析而言隨著溫度升高，昆侖雪菊色素提取率的變化呈現(xiàn)出相關(guān)性，當溫度超過70 ℃，提取液吸光度下降明顯（圖3）。故從高溫對色素的提取所帶來的有效成分易被破壞、溶劑易揮發(fā)等方面考慮，選擇溫度為70 ℃。

2.3.2 超聲時間對提取效果的影響 提取溫度70 ℃，其他條件不變，選擇超聲時間分別為15，30，45，60，75 min進行比較。隨著超聲時間的增加，昆侖雪菊色素提取率亦呈現(xiàn)相關(guān)性，當超聲時間為60 min時，昆侖雪菊色素提取液吸光度達到峰值，溶出的色素隨著時間和光照的增加而發(fā)生氧化降解，從而降低色素的含量[13]（圖4）。為得到最佳實驗條件，選擇超聲處理時間為60 min。endprint

2.3.3 液料比對提取效果的影響 固定超聲時間后，其他條件不變，選擇液料比分別為20∶1，30∶1，40∶1，50∶1，60∶1 mL·g^-1進行分析，因涉及不同質(zhì)量比問題，采用色價來表示相對濃度，進行計算后比較。色價 ，式中，A表示吸光度，m表示樣品質(zhì)量，f表示稀釋倍數(shù)。

在液料比為30∶1 mL·g^-1時，相對濃度達到峰值，昆侖雪菊色素在提取溶劑中的溶出已基本達到動態(tài)平衡。超過30∶1 mL·g^-1后，相對濃度又逐漸下降，液料比過大則增加抽濾操作的能耗和原材料的浪費，由此可得最佳的液料比為30∶1 mL·g^-1（圖5）。

2.3.4 溶劑濃度對提取效果的影響 固定液料比后，其他條件不變，選擇不同的乙醇濃度分別為50%，60%，70%，80%，95%進行比較。溶劑濃度低于70%時，水溶性雜質(zhì)溶出多，提取液較渾濁，不利于色素分離純化。昆侖雪菊色素提取液吸光度在70%濃度處達到峰值，提取溶劑濃度大于70%會將樣品中的油脂和糖類物質(zhì)提取出來，提取液較澄清，但色素溶出減少（圖6）。慮及成本控制，選擇溶劑濃度為70%。

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化超聲輔助提取昆侖雪菊色素試驗

2.4.1 超聲輔助提取昆侖雪菊色素響應(yīng)面試驗 以單因素實驗結(jié)果為依據(jù)，為考察不同因子對提取效果的影響順序以及不同因子之間的交互作用，根據(jù)Box-Behnken的實驗設(shè)計原理，選擇4個因素：提取溫度（A）、超聲時間（B）、液料比（C）、溶劑濃度（D），進行4因素3水平的響應(yīng)面分析實驗（表1）。

本研究以吸光度為應(yīng)變量。

2.4.2 超聲輔助提取昆侖雪菊色素響應(yīng)面試驗及方差分析 通過Design-Expert 8.0軟件進行二次響應(yīng)面回歸分析（表2），由于BC之間的交互作用不顯著，故在構(gòu)建方程時應(yīng)予以去除，此時模擬的失擬項由原來的0.059 8方差比值升高到0.060 6，提高了方程的擬合效果。AC，AB，AD，CD之間的交互作用也不顯著，但從模型中去除就會使模型的失擬項升高，從而降低方程的擬合效果，應(yīng)納入模型[14]。得到多元二次響應(yīng)面回歸模型如下。

Y=0.70+0.026A+0.032B+0.027C+0.034D+0.023AB-0.022AD+0.036BD+0.025CD-0.047A²-0.063B²-0.080C²-0.063D²

方差分析得出昆侖雪菊色素提取方程的一次項和二次項極其顯著（表3），說明各具體因素對響應(yīng)值的影響不是簡單的一次線性關(guān)系，所選因素之間存在顯著的交互作用。該模型極顯著（P<0.01），回歸系數(shù)R²=0.937 9，失擬項P= 0.060 6>0.05，不顯著，說明該回歸模型與實驗數(shù)據(jù)擬合程度較高，實驗誤差小，可以用該模型分析和預(yù)測昆侖雪菊色素提取的效果。利用Design-Expert 8.0軟件進行擬合，直觀了解各因素之間兩兩交互作用對昆侖雪菊色素提取效果的影響（圖7～12），若曲線走勢越陡，表明該因素對提取效果影響越顯著，相應(yīng)表現(xiàn)為響應(yīng)值的變化[15]。而通過等高線圖可以看出存在極值的條件應(yīng)該在圓心處[16]。

通過Design-Expert 8.0軟件分析，由響應(yīng)曲面和等高線圖以及回歸方程可知，提取昆侖雪菊色素的最佳實驗條件為：提取溫度70 ℃、超聲時間60 min、液料比32.05∶1 mL·g^-1、溶劑濃度72.25%。按上述實驗條件進行提取驗證實驗，測到色素提取液吸光度達到0.936與預(yù)測值0.957接近，說明該方程與實際情況擬合良好，適于對昆侖雪菊色素提取工藝進行回歸分析和參數(shù)優(yōu)化。

3 討論

天然色素具有天然和健康的屬性，使天然色素的種類和市場需求量大幅度增加[17]。傳統(tǒng)浸提法提取昆侖雪菊色素效率低下，本研究根據(jù)我國食品添加劑標準規(guī)定以吸光度來表示色素濃度。實驗表明超聲輔助提取法較傳統(tǒng)浸提法在提取昆侖雪菊色素時具有一定優(yōu)勢，昆侖雪菊色素在380 nm處有最大吸收波長。將在此波長下測定吸光值作為指標，380 nm為黃酮類成分特征吸收峰，經(jīng)三氯化鐵顯色反應(yīng)以及中性乙酸鉛沉淀反應(yīng)實驗驗證，推測昆侖雪菊色素以黃酮類成分為主[18]。通過單因素實驗，初步確定了反應(yīng)條件。

利用響應(yīng)面設(shè)計實驗，運用根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗設(shè)計原理來尋求最優(yōu)的考察因素和響應(yīng)值來避免傳統(tǒng)數(shù)理統(tǒng)計存在的問題，最終精確找到最佳點并靈敏地考察各因素間的交互作用[19]。本研究選擇了4個因素：提取溫度（A）、超聲時間（B）、液料比（C）、溶劑濃度（D），根據(jù)單因素實驗結(jié)果進行4因素3水平的響應(yīng)面分析實驗，由回歸系數(shù)檢驗值F可知，4個因素對昆侖雪菊色素提取效果影響程度依次為溶劑濃度>超聲時間>液料比>提取溫度[20]。在對模型優(yōu)化后，最終得到實驗條件最優(yōu)值：提取溫度70 ℃、超聲時間60 min、液料比32.05∶1 mL·g^-1、溶劑濃度72.25%。在此條件下進行驗證試驗，色素提取液吸光值達到0.936。

本實驗運用超聲波輔助提取昆侖雪菊色素，利用響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，但還需進一步深入研究，主要體現(xiàn)在以下幾個方面：對昆侖雪菊色素成分的測定，進而對色素樣品進行純化;對純化后的產(chǎn)物進行性質(zhì)測定以及藥理研究[21]，進一步分離，以期獲得純度更高效果更好的昆侖雪菊色素。endprint

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Response surface optimization of ultrasonic-assisted pigment

extraction from Coreopsis tinctoria

XU Lu， WANG Tao， GUO Qiao-sheng， LI Wei-lin

（Institute of Chinese Medicinal Materials， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China;

2.Institute of Botangy， Jiangsu Provinceand the Chinese Academy of Science， Nanjing 210014， China）

[Abstract] Response surface methodology （RSM） was used to optimizing the ultrasonic-assisted extraction technology of pigment from Coreopsis tinctoria. The results showed that the flavonoids were the main constituents of the pigment. Based on single factor experiments， a four-factor-level experiment design were developed by box-benhnhen central composite design method with causal factors of ultrasonic temperature， ultrasonic time， ratio of liquid to raw material， the concentrations of ethanol in solvent and the extract absorbance value for the response. The interactive effects of four crucial technological parameters were assessed by response surface methodology （RSM）.The optimum ultrasonic-assisted extraction conditions were as follow： ultrasonic temperature was 70 ℃， ultrasonic time was 60 min， the concentrations of ethanol in solvent was 72.25% and the ratio of liquid to raw material was 32.05∶1 mL·g^-1. Under the optimum extraction technology conditions， the absorbance value was 0.936. The conditions are suitable for the extraction process regression analysis and parameter optimization.

[Key words] Coreopsis tinctoria; ultrasonic; response surface methodology; pigment

doi：10.4268/cjcmm20142419

[責任編輯 馬超一]endprint