蒸制和烘制對附子生物堿成分含量的影響研究

楊昌林+黃志芳+張意涵+劉玉紅+劉云華+陳燕+易進海

[摘要] 研究蒸制和烘制對附子生物堿含量的影響，采用UPLC-MS/MS方法，多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）同時測定附子中13種生物堿成分的含量。結(jié)果表明蒸制過程中附子雙酯型生物堿含量迅速降低，單酯型生物堿含量先升后降，于40 min時達(dá)到最高峰，原堿中烏頭原堿、新烏頭原堿、次烏頭原堿快速增加，附子靈、宋果靈、多根烏頭堿和去甲豬毛菜堿含量相對穩(wěn)定或略有降低。烘制過程中生物堿成分的動態(tài)變化趨勢與蒸制過程有明顯差異，雙酯型生物堿降解速度比蒸制稍慢，單酯型生物堿、原堿和總生物堿被不同程度破壞，含量顯著低于同時間點蒸制附片。該研究揭示了附子蒸制或烘制過程中生物堿成分的動態(tài)變化規(guī)律，2種炮制方法均能有效去除毒性成分并保留有效成分，工藝簡便易行，方法可控，具有推廣和應(yīng)用價值。

[關(guān)鍵詞] 附子;生物堿;UPLC-MS/MS;炮制;變化規(guī)律

[收稿日期] 2014-05-28

[基金項目] 國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（973）項目（2009CB522804）;國家科技支撐計劃項目（2011BAI13B05）

[通信作者] 易進海，研究員，研究方向為中藥化學(xué)成分與質(zhì)量評價，Tel：（028）85210843，E-mail：yijinhai63@163.com

[作者簡介] 楊昌林，研究實習(xí)員， E-mail：jilang8351@sina.com

附子來源于毛茛科植物烏頭Aconitum carmichaelii Debx.子根的加工品，具有回陽救逆、補火助陽、散寒止痛之功效，其“補火助陽之要藥”地位被歷代醫(yī)家推崇?，F(xiàn)代研究表明附子主要毒/效成分為生物堿，包括雙酯型生物堿、單酯型生物堿、原堿等[1-2]，其中，雙酯型生物堿為附子劇毒性成分，單酯型生物堿具有鎮(zhèn)痛和抗炎等作用[3-4]，附子靈和宋果靈具有鎮(zhèn)痛、降壓作用[5]，次烏頭原堿、新烏頭原堿等原堿和去甲豬毛菜堿均有強心作用[6-7]。附子炮制可使雙酯型生物堿水解轉(zhuǎn)化為單酯型生物堿及原堿，減毒存效，其方法囊括炮、炒、煨、蒸、煮等數(shù)十種，2010年版《中國藥典》收載的黑順片、白附片、淡附片和炮附片，即是附子經(jīng)過膽巴水浸制、煮、漂、蒸、曬等工藝加工炮制而成，然法定方法過程繁雜，可控性差，不同批次制附片中生物堿成分含量相差可高達(dá)10倍，有效成分流失嚴(yán)重，存在炮制過度之嫌[8-11]，且漂洗不徹底還可導(dǎo)致CaCl₂，MgCl₂等無機雜質(zhì)的殘留[12]。目前，已有文獻報道了蒸制和烘制對附子6種酯型生物堿含量的影響[13]，本文進一步探討附子直接蒸制或烘制方法的可行性，采用UPLC-MS/MS檢測技術(shù)，研究13種主要生物堿成分的動態(tài)變化規(guī)律，以期為附子炮制提供簡便可行的加工方法。

1 材料

Agilent 1200型高效液相色譜儀（美國Agilent公司），Agilent 6460型三重四極桿質(zhì)譜儀（美國Agilent公司），Agilent Masshunter B.03.01 SP2工作站軟件（美國Agilent公司），KQ-100超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司），TDL80-2B臺式離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠），SYQ-DSX-280不銹鋼壓力蒸氣滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠），DHG-9240A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司），AUW220D型1/10萬天平（日本島津公司），Milli-Q純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）。

實驗藥材購于四川江油中壩附子科技發(fā)展有限公司，由四川省中醫(yī)藥科學(xué)院舒光明研究員鑒定，為烏頭A. carmichaelii Debx.子根的加工品。氫溴酸高烏甲素（lannaconitine，批號100289-200902），苯甲酰次烏頭原堿（benzoylhypaconine，批號111796-201002），苯甲酰新烏頭原堿（benzoylmeaconine，批號111795-200901），苯甲酰烏頭原堿（benzoylaconine，批號111794-200901），烏頭堿（aconitine，批號110720-200410），新烏頭堿（mesaconitine，批號110799-200505），次烏頭堿（hypaconitine，批號110798-201106）對照品購自中國食品藥品檢定研究院;去甲豬毛菜堿對照品（salsolinol，批號1-LJM-177-1）購自Toronto Research Chemicals Inc;烏頭原堿（aconine，批號must-11051501），宋果靈（songorine，批號must-12090504），多根烏頭堿（karacoline，批號must-13021802），附子靈（fuziline，批號must-12090810）對照品購自成都曼思特生物科技有限公司;次烏頭原堿（hypaconine），新烏頭原堿（mesaconine）對照品由本實驗室從制川烏中分得，HPLC峰面積歸一化法分析，純度均≥98.0%;乙腈、甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 炮制加工方法與樣品制備

濕熱蒸制：取生附片6 kg，加適量水潤透，分成6等份，置不銹鋼壓力蒸氣滅菌器內(nèi)，分別于120 ℃蒸10，20，40，60，90，120 min，曬干，即得蒸附片。

干熱烘制：取生附片6 kg，分成6等份，置電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)，分別于150 ℃烘10，20，40，60，90，120 min，即得烘附片。

2.2 LC-MS/MS測定附子13種生物堿的含量

2.2.1 測定條件 液相條件：Agilent SB-C₁₈色譜柱（2.1 mm×20 mm，1.8 μm）;柱溫35 ℃;流動相A為0.1%甲酸乙腈溶液，B相為2 mmol·L^-1乙酸銨溶液+0.1%甲酸;流速0.4 mL·min^-1;進樣量1 μL。梯度洗脫：0～1.5 min，15%～20% A;1.5～5 min，20% ～70% A;5～5.1 min，70% ～100% A;5.1～8 min，100% A。endprint

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI），正離子模式下進行數(shù)據(jù)采集，毛細(xì)管電壓4 kV，干燥氣溫度350 ℃，干燥氣流速11 L·min^-1，霧化氣壓力310 kPa。13種生物堿及內(nèi)標(biāo)的主要質(zhì)譜分析參數(shù)見表1，上述條件下所測定各成分的MRM圖見圖1。

2.2.2 對照品溶液及內(nèi)標(biāo)溶液的制備 精密稱取13種對照品適量，分別置于25 mL量瓶中，加0.05 mol·L^-1鹽酸溶液溶解定容到刻度，配置成每1 mL含烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、次烏頭原堿、附子靈、宋果靈、多根烏頭堿、去甲豬毛菜堿0.5 mg，新烏頭原堿0.25 mg，烏頭原堿0.05 mg，新烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿1 mg的單標(biāo)儲備溶液。取各單標(biāo)儲備溶液1 mL至25 mL量瓶中，用0.05 mol·L^-1鹽酸溶液定容到刻度，得混合對照品儲備溶液。

精密稱取氫溴酸高烏甲素對照品適量，用甲醇配制成質(zhì)量濃度約為25 mg·L^-1的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取各樣品粉未（過3號篩）約2 g，精密稱定，精密加入0.05 mol·L^-1鹽酸溶液50 mL，搖勻，超聲提取30 min，冷卻至室溫，3 000 r·min^-1離心10 min，取上清液0.4 mL置10 mL量瓶中，加1 mL內(nèi)標(biāo)溶液，再加甲醇定容至刻度，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

2.2.4 線性關(guān)系及檢出限、定量限 取上述混合對照品儲備溶液，精確配制一系列不同質(zhì)量濃度的混合對照品工作溶液，每個濃度各加入1 mL內(nèi)標(biāo)溶液，加甲醇定容至10 mL，即得。按2.2.1項下條件測定，以對照品進樣量與內(nèi)標(biāo)進樣量之比為橫坐標(biāo)，對照品峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。最小濃度對照品工作溶液逐級稀釋進樣，以信噪比S/N為3∶1確定最低檢出限，以信噪比S/N為10∶1確定定量限，結(jié)果見表2。

由表2和圖1可知，13種生物堿在上述線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，無干擾，儀器檢出限及定量限能達(dá)到樣品含量測定要求。

2.2.5 精密度試驗 取生附片供試品溶液，重復(fù)進樣6次，記錄峰面積。結(jié)果去甲豬毛菜堿、新烏頭原堿、多根烏頭堿、烏頭原堿、宋果靈、次烏頭原堿、附子靈、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿定量離子峰與氫溴酸高烏甲素定量離子峰面積比值的RSD分別為1.9%，2.8%，1.6%，2.3%，1.8%，2.7%，0.80%，1.1%，2.0%，0.70%，1.2%，1.6%，1.4%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗 取生附片供試品溶液，室溫放置0，1，2，4，8，10，12，24 h后，按上述測定條件測定，記錄峰面積。結(jié)果上述13種生物堿定量離子峰與氫溴酸高烏甲素定量離子峰面積比值的RSD依次為2.3%， 3.6%，1.8%，2.9%，2.2%，2.9%，1.3%，1.5%，2.3%，1.9%，1.8%，2.0%，1.8%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 重復(fù)性試驗 取生附片約2 g，共6份，精密稱定，按2.2.3項下方法制備供試品溶液，精密吸取1 μL，注入液質(zhì)聯(lián)用儀，記錄峰面積，計算含量。上述13種生物堿含量的RSD依次為3.1%，3.4%，1.5%，3.8%，2.0%，2.9%，1.4%，1.0%，2.1%，1.9%，1.2%，1.7%，1.7%，表明重復(fù)性良好。

2.2.8 回收率試驗 取已知含量的生附片1 g，精密稱定，共6份，準(zhǔn)確加入與樣品中含量相當(dāng)?shù)膶φ掌啡芤?，?.2.3項下方法制備供試品溶液，測定，記錄峰面積，計算回收率。結(jié)果上述13種生物堿平均回收率依次為86.4%，96.6%，95.3%，96.4%，94.9%，93.2%，99.0%，95.1%，98.9%，95.6%，94.2%，101%，96.2%，RSD分別為0.90%，1.3%，1.8%，4.4%，1.2%，1.9%，1.7%，3.3%，4.2%，2.6%，1.5%，1.0%，2.6%。

2.2.9 含量測定 取各附片樣品，按2.2.3項下方法操作，每個批次樣品制備3份供試品，進樣，測定峰面積，內(nèi)標(biāo)法計算，結(jié)果見表3，4。

3 結(jié)論

本研究首先對蒸制和烘制的溫度、時間條件進行了預(yù)實驗比較研究，確定蒸制、烘制的溫度分別為120，150 ℃，炮制時間分別選擇10，20，40，60，90，120 min，得到12批制附片樣品，采用LC-MS/MS技術(shù)測定各樣品中13種主要生物堿成分的含量。研究結(jié)果表明（表3，4）：蒸制過程中，雙酯型生物堿含量迅速降低，20 min時蒸附片中3種雙酯型生物堿的總量就已低于0.020%，即符合2010年版《中國藥典》附子雙酯型生物堿檢查項下的規(guī)定;單酯型生物堿含量先升后降，約在40 min達(dá)到最大值，該時段以雙酯型生物堿水解轉(zhuǎn)化為單酯型生物堿為主，此后含量緩慢降低，以單酯型生物堿水解轉(zhuǎn)化為原堿為主。蒸制過程中，烏頭原堿、新烏頭原堿、次烏頭原堿含量一直呈現(xiàn)快速增加趨勢，120 min時達(dá)最高峰，約為生附片含量的10～20倍，系酯型生物堿不斷水解轉(zhuǎn)化所致，而附子靈、宋果靈、多根烏頭堿和去甲豬毛菜堿含量相對穩(wěn)定或略有降低。與蒸制過程比較，烘制條件下雙酯型生物堿降解速度稍慢，約40 min時達(dá)到藥典標(biāo)準(zhǔn)（不得過0.020%）;單酯型生物堿變化規(guī)律雖與蒸制相似，但3種單酯型生物堿的總量明顯低于蒸附片，約為蒸附片的50%～70%。有趣的是各批烘附片中烏頭原堿、新烏頭原堿、次烏頭原堿含量相當(dāng)、變化不大，約為生附片含量的2倍，極顯著低于蒸附片;而附子靈、宋果靈、多根烏頭堿和去甲豬毛菜堿隨烘制時間的增加含量逐漸降低，提示該4種成分長時間烘制不穩(wěn)定。綜上分析可見，蒸制和烘制過程中生物堿成分的動態(tài)變化規(guī)律有明顯差異，蒸附片中單酯型生物堿、原堿和總生物堿的含量明顯高于烘附片，但雙酯型生物堿含量低于烘附片，表明附子炮制方法不同，生物堿轉(zhuǎn)化方式和程度可能不同，從化學(xué)成分角度詮釋了附子不同炮制品的臨床功效和應(yīng)用方向可能不同。endprint

文獻報道[8-11]，附子用膽巴水浸制、煮、漂、蒸等處理，總生物堿下降為原生藥的1/6～1/9，損失率達(dá)80%以上，原堿相當(dāng)于原生藥的1/100左右，毒性生物堿和強心成分流失嚴(yán)重，以致毒性減弱，療效也隨之降低，存在炮制過度之嫌，正如張景岳所說：“制之太過，則但用附子之名耳，效與不效無以應(yīng)驗，今人只知附子之可畏，而不知太熟之無用”?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果，作者認(rèn)為生附子直接采用濕熱蒸制或干熱烘制，能有效去除毒性成分雙酯型生物堿，達(dá)到藥典要求，同時很好地保留了藥效成分單酯型生物堿、原堿和去甲豬毛菜堿等，且不含膽巴（無膽附片），生產(chǎn)工藝簡便易行，方法可控，具有推廣和應(yīng)用價值，建議《中國藥典》增加附子無膽炮制方法。

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Effects of steaming and baking on content of

alkaloids in Aconite Lateralis Radix （Fuzi）

YANG Chang-lin， HUANG Zhi-fang， ZHANG Yi-han， LIU Yu-hong， LIU Yun-huan， CHEN Yan， YI Jin-hai

（1. Sichuan Academy of Chinese Medicine Sciences， Chengdu 610041， China;

2. Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， Chengdu 611137， China）

[Abstract] To study the effect of steaming and baking process on contents of alkaloids in Aconite Lateralis Radix （Fuzi）， 13 alkaloids were analyzed by UPLC-MS/MS equipped with ESI⁺ion source in MRM mode. In steaming process， the contents of diester-diterpenoid alkaloids decreased rapidly， the contents of monoester-diterpenoid alkaloids firstly increased， reached the peak at 40 min， and then deceased gradually. The contents of aconine alkaloids （mesaconine，aconine and hypaconine） increased all the time during processing， while the contents of fuziline， songorine， karacoline， salsolionl were stable or slightly decreased. In baking process， dynamic variations of alkaloids were different from that in the steaming process. Diester-diterpenoid alkaloids were degraded slightly slower than in steaming process. Monoester-diterpenoid alkaloids、aconine alkaloids and the total alkaloids had been destroyed at different degrees， their contents were significantly lower than the ones in steaming Fuzi at the same processing time. This experiment revealed the dynamic variations of alkaloids in the course of steaming and baking. Two processing methods which can both effectively remove the toxic ingredients and retain the active ingredients are simple and controllable， and are valuable for popularization and application.

[Key words] Aconite Lateralis Radix; alkaloid; UPLC-MS/MS; processing; variation

doi：10.4268/cjcmm20142420

[責(zé)任編輯 馬超一]endprint