殼聚糖螯合凝膠層析法純化血液超氧化物歧化酶

王保全， 平 娟 ， 張永州， 黃繼海，李昭華， 董先智， 龐曉斌， 李梅基

（1.河南大學(xué) 淮河臨床學(xué)院，河南 開封 475001；2.中國科學(xué)院 生物物理研究所，北京 100101；3.河南大學(xué) 藥學(xué)院，河南 開封475001；4.蘭州大學(xué) 生物工程學(xué)院，甘肅 蘭州730000）

超氧化物歧化酶簡稱SOD，是廣泛存在于生物體內(nèi)的一種可防止氧化損傷和缺失的活性酶[1]，也是一種應(yīng)用廣泛的藥用酶[2]，具有抗衰老、預(yù)防輻射及治療炎癥等一系列功能[3]，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于食品及醫(yī)藥衛(wèi)生行業(yè)。

1975年proath首次提出固定化金屬螯合親和層析（IMAC），并發(fā)展成為一種有效的生化分離技術(shù)[4]，該方法是利用固定在基質(zhì)上的過渡態(tài)金屬離子和蛋白質(zhì)表面的組氨酸、半胱氨酸、色氨酸等殘基的配位作用，來實(shí)現(xiàn)對(duì)金屬離子有親和力的蛋白質(zhì)的吸附和分離。其中組氨酸是與金屬離子作用較強(qiáng)的氨基酸 ，含有較多組氨酸的蛋白質(zhì)（如SOD）可以在IMAC介質(zhì)中有效的保留，故多聚組氨酸已經(jīng)成為最常用的蛋白質(zhì)純化標(biāo)簽[5]。在制備親和介質(zhì)時(shí)，常用的金屬離子有Cu2+，Zn2+和Ni2+等，常用的螯合配基有亞氨基二乙酸 （IDA），三羧基甲基乙二胺（TED），次氨基三乙酸（NTA）等[6-7]。固定化螯合親和色譜常常以凝膠為載體，如在SephadexG-75或者DEAE-superpose等凝膠上用化學(xué)交聯(lián)方法引入螯合劑IDA，再通過交聯(lián)固定和親和配 （Ba2+，Cu2+，Zn2+）。用該方法制備的凝膠介質(zhì)生產(chǎn)成本很高，軟基質(zhì)很易被壓縮，不易被放大生產(chǎn)。近年來，隨著基因工程下游技術(shù)的發(fā)展，基因重組蛋白質(zhì)的分離純化技術(shù)越來越顯示其重要性，金屬螯合層析技術(shù)（IMAC）分辨率高、選擇性好，能在常規(guī)的變性條件下及非變性條件下進(jìn)行蛋白質(zhì)組分分離純化。研究表明[8-9]，影響金屬螯合層析的因素很多，但是決定色譜填料分離效果的主要因素在于填料的性質(zhì)、基質(zhì)種類、配基及所螯合的金屬離子種類等。國外有報(bào)道用硅膠來制備螯合介質(zhì)[10-11]，但硅膠顆粒很難被改性，而且生物相容性和親水性較差，易于吸附其他雜質(zhì)，所以不適合工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用。作者以殼聚糖為原料，以固定相偶聯(lián)的配基-亞氨基二乙酸（IDA）及金屬離子Cu2+發(fā)生螯合作用，制得金屬親和層析凝膠，改凝膠化學(xué)穩(wěn)定性好，基質(zhì)穩(wěn)定，容易再生，并首次以聚合高分子電解質(zhì)聚丙烯酸鈉對(duì)傳統(tǒng)血液超氧化物歧化酶提純工藝進(jìn)行改進(jìn)。改進(jìn)后的新工藝比傳統(tǒng)血液提純工藝大大縮短了分離流程，省去了氯仿、乙醇等有毒易污染的試劑。將金屬親和層析原理引入改進(jìn)后的新工藝中，用于分離純化血液SOD，達(dá)到了很好的純化效果，為工業(yè)上放大生產(chǎn)提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

新鮮豬血，北京市第五肉聯(lián)廠提供；檸檬酸三鈉，氯化銅，丙酮，北京化學(xué)試劑廠產(chǎn)品；聚丙烯酸（PAA），上海阿拉丁試劑總廠產(chǎn)品；不同相對(duì)分子質(zhì)量聚丙烯酸鈉（PAAS），由北京順義希濤化學(xué)試劑廠合成，固含3.45%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）；殼聚糖，脫乙酰度≥90%，Sigma公司進(jìn)口分裝；SOD活性試劑盒，南京建成生物公司產(chǎn)品；低相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，華美生物技術(shù)公司產(chǎn)品；SOD標(biāo)準(zhǔn)品，華美生物技術(shù)公司產(chǎn)品；臨苯三酚，國藥集團(tuán)產(chǎn)品；SephedexG-75，DEAE-sepherose-fast flow4B，瑞典 Pharmacia公司產(chǎn)品；UV-2010型紫外分光光度計(jì)，大型離心機(jī)，日本島津公司制造；DYY-6C型電泳儀，北京六一儀器廠制造；超濾杯，F(xiàn)D-IC-50冷凍干燥機(jī)，北京博益康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司制造；HD-5型紫外監(jiān)測(cè)儀，上海滬西分析儀器廠制造；其他試劑均為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 SOD的制備及PAAS相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)酶活性的影響 取新鮮抗凝血液，4 000 r/min離心45 min，或新鮮抗凝血靜止過夜分層后取下層血球，待用。取8份100 mL血球，加等體積含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.6%Tritonx-100的蒸餾水，磁力30 min攪拌溶血，然后加溶血體積的20%的固含為3.45%PAAS（相對(duì)分子質(zhì)量分別為 3 000，10 000，50 000，100 000，500 000，1 000 000，2 000 000，4 000 000）在水浴鍋中，將加入體積分?jǐn)?shù)20%PAAS后的溶血液加熱到60℃。等液體溫度達(dá)到70℃時(shí)再加10%溶血體積的氯化銅（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 10%）作為激活劑，恒溫10 min。將熱變后的溶血液用細(xì)紗過濾，收集濾液（觀察酶液顏色），加入2倍濾液體積預(yù)冷-4℃的丙酮，離心收集沉淀，沉淀（約2 mL）用pH為7.6的PBS溶解（加50倍于沉淀體積的PBS）。將上述酶液裝入超濾杯中，選用相對(duì)分子質(zhì)量為10 000的超濾膜反復(fù)超濾2～3次，收集膜上酶液，即為粗酶液。

1.2.2 殼聚糖自制親和凝膠的制備 取4 g殼聚糖，加入體積分?jǐn)?shù)1%的CH3COOH溶液，攪拌至完全溶解，滴入戊二醛至一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)（2‰），以質(zhì)量分?jǐn)?shù)（30%～40%）NaOH溶液調(diào)至堿性，磁力攪拌交聯(lián)6 h，在快速攪拌下加入NaOH溶液，使殼聚糖呈顆粒狀沉淀。收集沉淀，水洗至中性。稱取2 g NaBH4攪拌還原，水洗至中性，得戊二醛交聯(lián)濕狀殼聚糖。取其懸液調(diào)pH到12，取一定量交聯(lián)殼聚糖懸液滴入一定量的環(huán)氧氯丙烷，于恒溫振蕩器中振蕩反應(yīng)2 h，將其洗滌至中性，抽干。按活化殼聚糖的比例加入2 g亞氨基二乙酸鈉在恒溫振蕩器中，于一定溫度（65℃）反應(yīng)一段時(shí)間（24 h）。洗滌至中性，用布氏漏斗抽干，得殼聚糖親和凝膠。

1.2.3 Cu2+的螯合、平衡和SOD的純化 取以殼聚糖為載體合成的親和吸附劑裝柱（4 cm×20 cm），用0.1 mol/L的CuSO4灌注至飽和吸Cu2+。螫合柱用含0.5 mol/L 的 NaCI，pH 7.5，0.05 mol/L 的磷酸鉀緩沖液進(jìn)行平衡過夜后，取豬紅細(xì)胞Cu-Zn SOD粗提液上樣。先以上述平衡液進(jìn)行平衡洗脫，再以含0.5 mol/L NaCl，0.05 mol/L L 咪唑的 pH 7.5，0.05 mol/L 的磷酸鉀緩沖液進(jìn)行洗脫。控制體積流量為15 mL/h，每2 mL收集一管，并以紫外檢測(cè)儀檢測(cè)，冷凍干燥。

1.2.4 SOD凝膠過濾層析純化 預(yù)先裝好Sepedex G-75 柱（1 cm×60 cm），柱子事先用 0.05 mol/L pH 7.6的PBS平衡過夜，然后把上述酶液上柱，紫外監(jiān)測(cè)儀檢測(cè)，收集蛋白質(zhì)活性峰，用恒流泵控制體積流量為1 mL/min，每5 min收集一管，收集上述各個(gè)蛋白質(zhì)峰，經(jīng)超濾濃縮、透析除鹽后，冷凍干燥24 h得到淺藍(lán)色固體粉末。詳見文獻(xiàn)[12]。

1.2.5 SOD離子交換層析純化 預(yù)先裝好的DEAE-superpose-fast flow 4B 柱（2 cm×60 cm）用 0.05 mol/L pH為7.8的PBS平衡過夜，酶液上柱后，用0～2 mol/L的氯化鈉溶液進(jìn)行梯度洗脫，并用紫外監(jiān)測(cè)儀檢測(cè)，恒流泵控制體積流量為2～3 mL/min，收集蛋白質(zhì)活性峰 ，收集上述各個(gè)蛋白質(zhì)峰，經(jīng)超濾濃縮、透析除鹽后，冷凍干燥24 h得到淺藍(lán)色固體粉末。詳見文獻(xiàn)[13]。

1.2.6 蛋白質(zhì)含量測(cè)定 考馬斯亮藍(lán)方法測(cè)定，以牛血清白蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，蛋白質(zhì)紫外吸收值為縱坐標(biāo)，繪制蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性回歸方程為：A=0.102C-0.025 3，R2=0.991 5。

1.2.7 SOD活力的測(cè)定 按照SOD試劑盒說明進(jìn)行。

1.2.8 酶紫外吸收光譜測(cè)定 取經(jīng)純化的酶，溶于適量的蒸餾水，用UV-2001型紫外分光光度計(jì)在200～500 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描[14]。

1.2.9 SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳 測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量和純度分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%，濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%，電極緩沖液為pH 8.3 Tris-Gly緩沖液；電流條件：12 mA 50 min，50 min 后 24 mA，2～3 h。

2 結(jié)果與分析

2.1 殼聚糖螯合金屬層析介質(zhì)的作用機(jī)理

殼聚糖螯合金屬層析技術(shù)是建立在蛋白質(zhì)表面的氨基酸和固定化金屬離子的親和力的不同來進(jìn)行蛋白質(zhì)分離純化的一項(xiàng)技術(shù)，過渡態(tài)的金屬離子能夠與電子供體，如氮，硫，氧等原子以配位鍵結(jié)合，金屬離子上剩余的空軌道是電子供體的配位點(diǎn)，當(dāng)它在溶液中時(shí)會(huì)被水分子或陰離子占據(jù)。然而，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)表面氨基酸殘基與金屬離子的結(jié)合力較強(qiáng)時(shí)，氨基酸殘基的供電原子就會(huì)與金屬離子結(jié)合形成復(fù)合物，取代原先結(jié)合的水分子或陰離子，這樣就能使蛋白質(zhì)分子結(jié)合在固體表面。SOD含有相對(duì)較多的組氨酸上的咪唑基，可以與螯合柱上的金屬離子特異性結(jié)合，然后通過特殊質(zhì)子化洗脫而達(dá)到分離純化，作用機(jī)理見圖1。

圖1 殼聚糖螯合凝膠層析對(duì)蛋白質(zhì)的作用機(jī)理Fig.1 Mechanism of the chitosan gel chromatography on the protein

2.2 不同相對(duì)分子質(zhì)量聚丙烯酸鈉對(duì)SOD酶活性的影響

固定PAAS用量為20%（體積分?jǐn)?shù)），氯化銅用量為10%，另外pH值恒定7.8，考察不同相對(duì)分子質(zhì)量（3 000，10 000，50 000，100 000，500 000，1 000 000，2 000 000，4 000 000）的 PAAS 對(duì)酶活性的影響，并從實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象和酶液顏色來確定最佳相對(duì)分子質(zhì)量，這些相對(duì)分子質(zhì)量涉及了低相對(duì)分子質(zhì)量、中相對(duì)分子質(zhì)量，高相對(duì)分子質(zhì)量3個(gè)階段。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在相對(duì)分子質(zhì)量大于10 000時(shí)，酶液顏色有顯著變化。中相對(duì)分子質(zhì)量和高相對(duì)分子質(zhì)量PAAS，由于其黏性很大，導(dǎo)致酶液過濾困難，并且高分子PAAS由于對(duì)血液細(xì)胞有很強(qiáng)的蓄積作用，導(dǎo)致熱變反應(yīng)很不徹底，所以選用低相對(duì)分子質(zhì)量的PAAS效果較好，見圖2。

2.3 純化各步驟層析譜圖

由層析譜圖3—5可以知道，超濾濃縮后的粗酶液，經(jīng)離子交換和凝膠過濾層析，金屬親和凝膠層析純化后，均出現(xiàn)兩個(gè)明顯的蛋白質(zhì)活性吸收峰，經(jīng)活性檢測(cè)得知，大峰中SOD的活性明顯較高，小峰沒有明顯的蛋白質(zhì)活性，驗(yàn)證了金屬親和凝膠層析的可靠性和代替?zhèn)鹘y(tǒng)昂貴填料的可能性。

圖2 不同相對(duì)分子質(zhì)量聚丙烯酸鈉對(duì)SOD酶活性的影響Fig.2 Effect of the molecular weight of PAAS on the enzyme activity

圖3 殼聚糖金屬親和層析譜圖Fig.3 Chistosan metal affinity chromatography spectra

圖4 凝膠過濾層析譜圖Fig.4 Gel filtration chromatography spectra

圖5 離子交換層析譜圖Fig.5 Ion exchange chromatography spectra

2.4 酶紫外吸收特性和酶種類鑒定結(jié)果

取金屬親和層析后冷凍干燥的純化酶在200～550 nm范圍內(nèi)掃描產(chǎn)品，酶的紫外吸收光譜表明最高吸收峰在 259、258 nm 處（UV ABS：0.328），次高峰在 265、266 nm 處 （UV ABS：0.314）， 呈典型 Cu Zn-SOD吸收光譜曲線[15]。如圖6所示。

圖6 純化后酶的紫外吸收?qǐng)D譜Fig.6 Ultraviolet absorption of the enzyme

2.5 血液SOD純化后各步驟凝膠電泳圖及相對(duì)分子質(zhì)量的鑒定

如圖7—9所示。

圖7 凝膠過濾層析各步電泳圖Fig.7 Electrophoretogram of Purification steps by gel filtration chromatography

圖8 離子交換層析各步層析譜圖Fig.8 Electrophoretogram of Purification steps by ion exchange chromatography

圖9 殼聚糖金屬親和層析各步純化譜圖Fig.9 Electrophoretogram ofPurification stepsby chitosan affinity chromatography

2.6 血液（取新鮮豬血100 mL）SOD各步純化結(jié)果

100 mL的新鮮血球經(jīng)金屬螯合層析純化后，雖然酶活性不及傳統(tǒng)的離子交換和凝膠過濾層析等方法的，但是酶活性有很大的提高，產(chǎn)品得率和活性回收率分別達(dá)到15.5%和42.6%。見表1。

表1 血液SOD提純各個(gè)步驟純化結(jié)果表Table 1 Results of the purification steps of blood SOD

3 結(jié)語

層析純化是獲得蛋白質(zhì)多肽類藥物精品最關(guān)鍵的一步，對(duì)SOD的酶活性有很大的提高。作者制備了含殼聚糖為基礎(chǔ)基質(zhì)的螯合凝膠，并成功螯合了金屬Cu2+，采用增加離子強(qiáng)度或者降低pH值來洗脫純化蛋白質(zhì)。國外對(duì)層析純化的多步組合應(yīng)用研究較為活躍，Cui L Y等[16]依次采用熱處理、乙醇氯仿沉淀、冷丙酮沉淀和DEAE離子交換層析方法和羧甲基纖維素陽離子交換層析方法純化SOD粗品；Cheryl L等[17]人采用肝磷脂瓊脂糖凝膠層析柱（2.5 cm×20 cm）層析、Q-瓊脂糖凝膠層析、伴刀豆球蛋白質(zhì)A-瓊脂糖凝膠層析、MonoQ-瓊脂糖凝膠層析、Mono S-瓊脂糖凝膠層析等步驟純化小鼠肺細(xì)胞外液SOD，使酶活力進(jìn)一步提高。目前國內(nèi)外SOD的純化材料多用DEAE或者Sephedex等昂貴填料[18]，導(dǎo)致生產(chǎn)純化過程中純化成本較高。金屬螯合層析和普通的層析方法相比具有一些特殊的優(yōu)點(diǎn)：如親和配基Cu2+、Zn2+價(jià)廉易得，可以在高鹽濃度下操作，穩(wěn)定，容易再生，介質(zhì)化學(xué)穩(wěn)定性好，剛性強(qiáng)。制備的新型金屬螯合層析介質(zhì)可用于蛋白質(zhì)的分離純化，相比DEAE-52具有吸附容量大、吸附特異性高等優(yōu)點(diǎn)，但由于金屬螯合層析采用劇烈的洗脫條件洗脫，純化效果略低于離子交換層析和凝膠過濾層析的。

致謝：感謝中科院研究平臺(tái)為本實(shí)驗(yàn)提供了相關(guān)設(shè)備支持，特別感謝劉翠、李昭華、李梅基等給予的幫助。感謝河南大學(xué)藥學(xué)院相關(guān)老師的幫助，特別是中藥實(shí)驗(yàn)室李勉老師、方明月老師，在此一并感謝。

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