卵白蛋白水解產(chǎn)物的抗菌性及抗氧化性

唐文婷 ， 張 暉 ， 王 立 ， 錢海峰

（1.江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122；2.青島農(nóng)業(yè)大學 食品科學與工程學院，山東 青島 266109）

卵白蛋白（ovalbumin）是卵清中的一種磷酸糖蛋白質(zhì)，其質(zhì)量分數(shù)占卵清蛋白的54%左右[1]。其由386個氨基酸殘基組成，相對分子質(zhì)量約為45 000，等電點為4.5[2]。卵白蛋白具有典型的蛋白質(zhì)膠凝、乳化和起泡等功能特性，在食品加工中賦予食品各種風味、質(zhì)地和口感等感官特性。長期以來，卵白蛋白的研究主要集中于其結(jié)構(gòu)、功能特性和致敏性等相關領域。除膳食營養(yǎng)作用和作為胚胎發(fā)育中氨基酸來源之一以外，卵白蛋白的生理活性尚未受到廣泛關注。

因全球范圍內(nèi)細菌耐藥性的增強和合成食品防腐劑的潛在危害，抗菌肽作為一種新型抗菌劑受到國內(nèi)外研究者的廣泛關注。抗菌肽（Antibacterial peptides，AMPs）， 又 稱 肽 類 抗 生 素 （peptide antibiotics），是一類具有廣譜抗菌活性的小分子短肽，是生物天然免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分?？咕木哂胁煌趥鹘y(tǒng)抗生素的殺菌機制，不易產(chǎn)生病原菌耐藥性和交叉抗性，具有多重生物活性。此外，抗菌肽有較好的酸堿穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性和低溫貯藏穩(wěn)定性，在實際應用中具有獨特的使用特性，可用于醫(yī)藥、食品、飼料加工業(yè)等領域，具有極大的開發(fā)應用前景[3]。目前，抗菌肽的制備方法主要包括直接提取、化學合成、基因工程和酶水解。酶水解法具有安全性高、產(chǎn)量大、條件溫和、成本較低、操作簡便等優(yōu)點，故有望實現(xiàn)工業(yè)化規(guī)模性生產(chǎn)。

眾多食物蛋白質(zhì)經(jīng)過酶解后，可以釋放出一系列易吸收并具有抗菌、抗氧化、降血壓、抗凝血、抗腫瘤、促進礦物質(zhì)吸收、促進DNA合成等多種生理活性的多肽[4]。為深入了解卵白蛋白酶解產(chǎn)物的生理活性及開發(fā)新型生物活性肽，本實驗中采用胃蛋白酶、胰蛋白酶復合水解卵白蛋白，并對其抗菌活性組分進行分離純化，評價其抗菌活性、細菌細胞膜損傷性特性及抗氧化活性，旨在提高卵白蛋白的綜合利用水平和效益。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

卵白蛋白，實驗室自制（純度92.6%）。

胃蛋白酶（≥400 U/mg），Sigma公司產(chǎn)品；胰蛋白酶（≥50 000 U/g）、營養(yǎng)瓊脂（BR）、魚粉蛋白胨（BR）、牛肉浸膏（BR）、氯化鈉（分析純）、葡萄糖（分析純），國藥集團產(chǎn)品；GENMED半乳糖苷酶釋放法細菌膜損傷熒光檢測試劑盒，上海杰美基因公司產(chǎn)品；碘化丙錠，Aladdin公司產(chǎn)品。

大腸桿菌Escherichia coli ATCC 25922、金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus ATCC 25923，由江南大學食品學院提供。

1.2 儀器與設備

YXQ-LS-SH全自動立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠制造；SWCJ-1FD超凈工作臺，蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司制造；SPX-150 C型恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠制造；Free Zone 2.5型冷凍干燥機，美國Labconco公司制造；FORMA 702型超低溫冰箱，美國Thermo Scientific公司制造；A¨KTA蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)，瑞典Amersham Bioscience Co制造；HPLC色譜系統(tǒng)，Agilent Technologies公司制造；M5酶標儀，美國Molecular Devices公司制造；FACSCalibur流式細胞儀，美國Becton Dickinson公司制造。

1.3 試驗方法

1.3.1 卵白蛋白水解液的制備 配制質(zhì)量分數(shù)5%卵白蛋白懸濁液，用1 mol/L HCl調(diào)pH至2.0，攪拌加入1%質(zhì)量分數(shù)胃蛋白酶，37℃反應5 h，反應過程中以1 mol/L HCl維持pH值恒定。采用1 mol/L NaOH調(diào)pH至8.0終止胃蛋白酶水解反應。攪拌加入2%質(zhì)量分數(shù)胰蛋白酶，37℃反應8 h，反應過程中以1 mol/L NaOH維持pH值恒定。反應結(jié)束后，反應物沸水浴加熱10 min鈍化蛋白酶，調(diào)pH至7.0。 反應物離心 15 min（4 500 g，4 ℃），上清液凍干備用。

1.3.2 卵白蛋白水解物抑菌性質(zhì)的測定

1）抑菌能力測定：指示菌大腸桿菌、金黃葡萄球菌37℃培養(yǎng)至對數(shù)期，制成105CFU/mL菌懸液，均勻涂布至營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上。直徑6 mm的滅菌濾紙片分別浸泡于2 mg/mL卵白蛋白水解液和生理鹽水對照溶液中，取出置于含菌平板上，37℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)18 h，每種指示菌重復操作3個平板。培養(yǎng)結(jié)束后測定濾紙片的抑菌圈直徑大小（mm）。

2）抑菌率的測定：滅菌96孔板中依次加入100 μL 液體培養(yǎng)基、100 μL 活化菌懸液和 50 μL蛋白水解產(chǎn)物（50 μg/mL），37 ℃培養(yǎng) 18 h。 生理鹽水代替蛋白水解液作為對照?；靹蚝笾糜?7℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，酶標儀測定OD600值[5]。抑菌率按式（1）計算。

式（1）中，A0為對照的 OD600， A 為樣品的 OD600。

1.3.3 卵白蛋白水解液相對分子質(zhì)量分布的測定卵白蛋白水解物配成溶液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后采用 HPLC（TSKgel 2000 SWXL 柱：300 mm×7.8 mm）測定卵白蛋白水解液相對分子質(zhì)量分布。色譜條件為：柱溫30℃，流動相為乙腈/水/三氟乙酸（體積比45∶55∶0.1），體積流量 0.5 mL/min，紫外檢測波長為220 nm。

1.3.4 卵白蛋白水解物的分離純化 首先采用A¨KTA蛋白質(zhì)純化系統(tǒng) （GE Healthcare SuperdexTMSuperdex peptide 10/300 GL型凝膠柱）對卵白蛋白水解物進行粗分。分別采用2個柱體積的20%乙醇、超純水、0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）溶液對凝膠柱進行洗脫平衡。蛋白水解物配成10 mg/mL溶液， 經(jīng) 0.22 μm濾膜過濾后上樣 （0.5 mL）。0.05 mol/L HCl以0.5 mL/min體積流量洗脫2個柱體積。檢測波長220 nm，自動收集器收集吸各峰組分，100 Da透析袋透析并冷凍干燥。凍干粉復溶檢測抗菌率。由凝膠柱分離得到抗菌組分，配成2 mg/mL的溶液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后采用RP-HPLC（Kromasil C18柱：250 mm×10 mm）分離。 色譜條件為：柱溫25℃，流動相（A：0.1%（體積分數(shù)）三氟乙酸溶液；B：含0.1%三氟乙酸的體積分數(shù)80%乙腈溶液）體積流量 0.5 mL/min，梯度洗脫（30 min內(nèi)0%～100%B）。紫外檢測波長為215 nm。手動收集各吸收峰，凍干、復溶并檢測其抗菌率。

1.3.5 半乳糖苷酶釋放法測定卵白蛋白水解物對細菌細胞內(nèi)膜滲透性的影響 采用半乳糖苷酶釋放法測定卵白蛋白水解物對大腸桿菌細胞膜滲透性的影響。實驗采用GENMED半乳糖苷酶釋放法細菌膜損傷熒光檢測試劑盒，按說明書操作。以無菌生理鹽水為對照。實驗重復3次，數(shù)據(jù)取其平均值。

1.3.6 流式細胞儀測定卵白蛋白水解物對細菌細胞膜完整性的影響 取培養(yǎng)至對數(shù)生長后期的待測大腸桿菌菌液，加入100 μg/mL的卵白蛋白水解物，對照組加生理鹽水，37℃培養(yǎng)4 h。離心洗滌樣品，菌體用生理鹽水懸浮，調(diào)整菌濃度為106CFU/mL。加入碘化丙啶（PI）染液至終質(zhì)量濃度為50 μg/mL，37℃避光孵育30 min后離心，雙蒸水洗去多余的PI并用1 mL雙蒸水重懸，流式細胞儀檢測PI著染陽性細菌數(shù)[6]。

1.3.7 卵白蛋白水解物的DPPH·自由基清除能力分別配制卵白蛋白水解物溶液為0.1～2.0 mg/mL。向96孔板中分別加入 50 μL蛋白水解物溶液和150 μL DPPH·甲醇溶液（0.1 mmol/L），輕微振蕩混勻，室溫避光反應30 min。517 nm下測定樣品吸光值。以甲醇代替卵白蛋白水解物為空白對照。質(zhì)量分數(shù)0.5%原始卵白蛋白懸濁液3 000 g離心5 min，還原型谷胱甘肽作為參考對照，其余操作同上[7]。每個樣品重復測定3次，DPPH·自由基清除率以式（2）計算：

式（2）中，Ac為空白對照的 OD517， As為樣品的 OD517。

2 結(jié)果與分析

2.1 卵白蛋白水解物的抗菌作用

由圖1可見，卵白蛋白經(jīng)水解后對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都具有抗菌活性，而原始卵白蛋白對兩種指示菌均無抗菌活性。說明無抗菌活性的母體蛋白卵白蛋白經(jīng)胃蛋白酶、胰蛋白酶復合水解后可釋放出抗菌片段。且相同濃度的卵白蛋白水解物對大腸桿菌的抑菌圈直徑大于對金黃色葡萄球菌的，表明其對大腸桿菌的抑菌活性大于對金黃色葡萄球菌的抑菌活性。

圖1 卵白蛋白（1）及其水解液（2）對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌能力Fig.1 Antibacterial activities of ovalbumin hydrolysate against Escherichia coli and Staphylococcus aureus

2.2 卵白蛋白水解物相對分子質(zhì)量分布

為在后續(xù)試驗中選擇合適的分離系統(tǒng)和分離柱，對卵白蛋白水解產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量分布進行了考察。由圖2和表1可見，其相對分子質(zhì)量大多分布在6 000以下，相對分子質(zhì)量在1 000以下的組分占到了50%以上。

圖2 卵白蛋白水解產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量分布圖Fig.2 Relative molecular weigh distribution of ovalbumin hydrolysate

說明該水解物中含有大量的2～50個氨基酸殘基組成的肽類。這與其他研究者認為抗菌肽是由50個以下氨基酸組成的小分子肽類物質(zhì)的觀點相一致[8]。

表1 卵白蛋白水解產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量分布計算Table 1 Relative molecular weigh distribution of ovalbumin hydrolysate

以上結(jié)果表明，蛋白水解物的抗菌活性與相對分子質(zhì)量分布有關。

2.3 卵白蛋白水解物的分離純化

因抗菌肽的相對分子質(zhì)量多為6 000以下，故采用分離范圍為相對分子質(zhì)量100～7 000的10/300 GL型凝膠柱對卵白蛋白水解物進行分離。卵白蛋白水解物的洗脫圖譜如圖3所示，收集各洗脫峰凍干復溶并測定抗菌活性，僅發(fā)現(xiàn)峰2（F2組分，圖中箭頭所示）具有抗菌活性。將F2經(jīng)RP-HPLC再次分離，收集各洗脫部分并測定抑菌率（圖4）。抑菌率試驗結(jié)果表明，50 μg/mL的F21和F22組分對大腸桿菌分別具有84.6%和22.5%的抑菌率，對金黃色葡萄球菌分別具有53.3%和29.6%的抑菌率。

圖3 KTA蛋白純化系統(tǒng)分離卵白蛋白水解物洗脫圖譜Fig.3 Elution profile of ovalbumin hydrolysate separated with KTA protein liquid chromatography

圖4 RP-HPLC分離卵白蛋白水解物F2洗脫圖譜Fig.4 Elution profile of F2 separated with RP-HPLC

2.4 卵白蛋白水解物對大腸桿菌細胞膜滲透性的影響

β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）為一種細菌內(nèi)源性酶，僅當細菌細胞膜受到損害時才從胞內(nèi)釋放出細菌外[9]。試驗中采用甲基傘形酮酰β-D-半乳糖苷酸 （4-Methylumbelliferyl-β-D-galactoside） 作為β-半乳糖苷酶的底物。水解產(chǎn)生的甲基傘形酮具有藍色熒光，吸收峰是 365 nm，而散射峰是 460 nm，因此可以作為一種熒光檢測信號來評價細菌細胞膜損傷程度。從圖5可以看出，卵白蛋白水解物F21和F22作用于大腸桿菌后，溶液的熒光強度增加，說明F21和F22引起大腸桿菌膜透性增加，導致β-半乳糖苷酶的釋放量增大。熒光強度的變化5 h后趨于平緩，且相同時間內(nèi)F21對膜透性的影響大于F22。細胞膜是具有高度選擇性的滲透性膜，胞膜透性增加，導致細胞內(nèi)物質(zhì)溢出胞外，最終引起細菌死亡。

圖5 卵白蛋白水解物組分F21和F22對大腸桿菌細胞膜滲透性的影響Fig.5 Effect of ovalbumin hydrolysate fraction F21 and F22 on membrane permeabilization of E.coli

以上結(jié)果表明，卵白蛋白水解物F21和F22使大腸桿菌細胞膜透性發(fā)生改變，引起胞內(nèi)物質(zhì)外流，從而發(fā)揮抑菌作用。

2.5 卵白蛋白水解物對細菌細胞膜完整性的影響

碘化丙錠（propidine iodide，PI）是陽離子核酸熒光染料，不能進入活細胞的完整細胞膜，但卻能穿過破損的細胞膜而對細胞核染色。當細菌細胞膜受損，熒光強度會隨進入細胞內(nèi)的PI增多而增強，因此細菌發(fā)出熒光信號的強弱反映了其細胞膜受損傷的程度[10]。由圖6可見，與對照組相比，卵白蛋白水解物處理后大腸桿菌的PI陽性染色細胞數(shù)均增多。卵白蛋白水解物處理前的大腸桿菌PI染色率為 0.15%，見圖 6（a）；F21處理 4 h后，大腸桿菌染色細胞數(shù)增加到 72.54%，見圖 6（b）；F22處理4 h后，PI染色細胞數(shù)為7.42%，見圖6（c）。

圖6 PI流入F21和F22處理后的大腸桿菌流式分析結(jié)果Fig.6 Flow cytometric analysis of Escherichia coli ATCC 25922 cells labeled with PI （a） and cells treated with ovalbumin hydrolysatesfraction F21 and F22F21（b） and F22 （c）

相同處理時間下，F(xiàn)21處理后的大腸桿菌的PI陽性染色細胞數(shù)大于F22處理后的菌體的，這與2.3中得到的兩者抑菌率結(jié)果一致。由此可知卵白蛋白水解物可以破壞細菌細胞膜的完整性。

2.6 卵白蛋白水解物的DPPH·自由基清除能力

眾多蛋白水解片段具有多重生物活性，如抗菌、抗氧化、降血壓、降膽固醇、抗癌等。為驗證已分離出的具有抗菌作用的卵白蛋白水解片段F21和F22是否具有其他活性，實驗中也考察了F21和F22的DPPH·清除能力。DPPH·自由基含單電子，在517 nm波長處有強烈吸收。當存在自由基清除物時，其在該波長下的吸光值會減小[11]。試驗以GSH為對照，考察了F21和F22對 DPPH·清除能力的影響。圖7表明，在0.1～2.0 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，卵白蛋白水解物對DPPH·清除能力均隨質(zhì)量濃度的增大而增大。質(zhì)量濃度低于2.0 mg/mL時，相同質(zhì)量濃度的F22的DPPH·清除能力高于F21的。當質(zhì)量濃度增加至2.0 mg/mL時，兩者DPPH·清除率相當，接近于1.0 mg/mL GSH的 DPPH·清除效果，表現(xiàn)出較強的DPPH·清除能力。

試驗中也考察了質(zhì)量分數(shù)0.5%原始卵白蛋白懸濁液上清液的DPPH·清除能力，僅為17.0%。因此，卵白蛋白經(jīng)酶解后使其抗氧化活性大大提高，其酶解片段同時具有抗菌活性和抗氧化活性。

3 結(jié)語

為探明蛋白酶解產(chǎn)物的生理活性，作者采用胃蛋白酶、胰蛋白酶復合水解卵白蛋白，通過A¨KTA蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)、透析及RP-HPLC得到2個具有抗菌活性的水解產(chǎn)物組分F21和F22，測定了其對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌率，相同質(zhì)量濃度的F21對大腸桿菌的抑菌率高于F22的，而對金黃色葡萄球菌的抑菌率低于F22的。半乳糖苷酶釋放法和流式細胞儀分析結(jié)果表明，2種產(chǎn)物均能破壞大腸桿菌細胞膜滲透性和細胞膜完整性，說明細菌細胞膜可能是其發(fā)揮抗菌性能的作用位點之一。此外，2種產(chǎn)物組分均能清除DPPH·自由基。因此，卵白蛋白水解產(chǎn)物在食品、醫(yī)藥等方面具有廣闊的應用前景。

圖7 卵白蛋白水解物組分F21和F22的DPPH·自由基清除能力Fig.7 DPPH free radicalscavenging abilities of ovalbumin hydrolysate fraction F21 and F22

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