球磨預處理和固態(tài)發(fā)酵對玉米秸稈飼用品質的影響

王璐璐 ， 蔡國林 ， 朱德偉 ， 陸 健 *

（1.江南大學 工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122；2.江南大學 糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫 214122；3.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122；4.宿遷市江南大學產業(yè)技術研究院，江蘇 宿遷 223800）

中國是一個農業(yè)大國，農作物秸稈資源十分豐富，年產量達8億多t，其中玉米秸稈最多，達到3億t。秸稈作為可再生資源，具有巨大的開發(fā)利用潛力。但是，在我國廣大農村地區(qū)，秸稈廢棄焚燒現(xiàn)象十分嚴重，這不僅造成了資源的巨大浪費，破壞生態(tài)平衡，而且違背了我國可持續(xù)發(fā)展的理念。因此，農作物秸稈資源利用技術的開發(fā)已成為生態(tài)農業(yè)和可持續(xù)發(fā)展的一個重大課題，世界上許多國家都在開展這方面的研究，如利用秸稈生產燃料乙醇、秸稈直燃發(fā)電、秸稈機械化還田以及制備秸稈飼料等[1]。

玉米秸稈主要由纖維素（31%～40%），半纖維素（35%～48%）和木質素（15%～25%）三種物質組成，其中纖維素和半纖維素都是潛在的可利用資源。但是，秸稈的物理-化學結構和組成因子阻礙了玉米秸稈的有效利用，纖維素的結晶度、可及表面積、木質素的屏障作用、生物質顆粒的不均勻性以及纖維素和半纖維素的纏繞等因素都不利于酶解反應的進行[2-3]。目前，研究最為廣泛的是采用蒸汽、氨化、稀酸等預處理，結合酶水解和發(fā)酵的多級加工過程可以將其轉化為生物燃料[4]。通過預處理改變或移除阻礙水解的因素，使得半纖維素和纖維素的對酶的敏感性提高，從而提高可還原糖的含量，提高玉米秸稈的生物利用度[5]。隨著機械行業(yè)的科技進步和酶制劑在飼料的廣泛應用，通過機械預處理玉米秸稈，進而通過纖維素酶和半纖維素酶酶解和有益微生物轉化，部分替代飼料中的糧食逐漸成為了可能[6]。

作者通過球磨預處理玉米秸稈，研究球磨預處理對玉米秸稈粒徑、化學結構成分、酶降解效率和乳酸菌固態(tài)發(fā)酵的影響，降低抗營養(yǎng)成分，提升營養(yǎng)價值，提高玉米秸稈的飼用品質，以期為實現(xiàn)處理后的玉米秸稈最終替代飼料中玉米或小麥等糧食提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

粗玉米秸稈：上海源耀生物科技有限公司提供 ； 纖 維 素 酶 （Validase TRL） 和 木 聚 糖 酶（BAKEZYME BXP 5001 BG）：由帝斯曼（中國）有限公司提供。球磨機：長沙天創(chuàng)粉末技術有限公司。

乳酸片球菌R30：江南大學糧食發(fā)酵工程實驗室釀造酒實驗室保藏，可利用木糖，纖維二糖等，且不存在葡萄糖阻遏效應。

1.2 玉米秸稈的預處理

分別取經干燥，切碎的粗玉米秸稈樣品（顆粒大小約0.5 cm）30 g，按以下方式分別進行機械預處理：錘式粉碎（5 min）和球磨（5 min）。

1.3 粒徑分布

粒徑分布的測定：MICROTRAC激光粒度分析儀測定。

1.4 中性洗滌纖維（NDF）和酸性洗滌纖維（ADF）測定

NDF含量的測定：按照GB/T 20806-2006飼料中中性洗滌纖維（NDF）的測定[7]。ADF含量的測定：按照NY/T 1459-2007飼料中酸性洗滌纖維（ADF）的測定[8]。

1.5 還原糖和可溶性總糖測定

1.5.1 樣品前處理 將2 g玉米秸稈樣品加入40 mL蒸餾水中，調節(jié)pH為中性，在80℃水浴中保溫30 min，使可溶性糖浸出，離心取上清液。

1.5.2 還原糖測定 采用DNS比色法[9]。

1.5.3 還原糖的HPLC測定 樣品經前處理后，取上清液過0.45 μm濾膜，采用高效液相色譜法（HPLC）測其還原糖。色譜柱：Aminex HPX-87H Ion Exclusion column；檢測器：示差折光檢測器；流動相：5 mmol/L H2SO4； 流速：0.4 mL/min； 柱溫：35℃。

1.5.4 總糖測定 采用硫酸-苯酚法測定總糖[10]。

1.6 單糖組成的測定

可溶性總糖經酸水解后，采用高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測（HPAEC-PAD）單糖組成。取1 mL玉米秸稈前處理后的上清液和4 mL、4 mol/L HCl于沸水浴中水解1 h，冷卻至室溫后加4 mL、4 mol/L NaOH中和，離心，過0.45μm濾膜，用高效陰離子交換色譜分析單糖含量。色譜柱：CarboPac PA20；檢測器：脈沖安培檢測器；流動相A：水；流動相 B：250 mmol/L NaOH； 流動相 C：1 mol/L NaAc；流速：0.5 mL/min；梯度洗脫條件：0～21.1 min，98.2%A，1.8%B；21.1～30 min，93.2%A，1.8%B，5%C；30 ～30.1 min，78.2%A，1.8%B，20%C；30.1 ～50 min，20%A，80%B。

1.7 酶解

用pH 5.5的檸檬酸鹽緩沖液配制木聚糖酶和纖維素酶混合酶液，酶添加量分別為400 U木聚糖酶/g秸稈和25 U纖維素酶/g秸稈，料液比（m/m）為1∶20，于 40 ℃酶解處理 1 h。

1.8 固態(tài)發(fā)酵

將秸稈樣品裝入廣口瓶105℃滅菌10 min，冷卻后接種10%乳酸菌，并添加木聚糖酶以及纖維素酶，酶添加量分別為400 U木聚糖酶/g秸稈和25 U纖維素酶/g秸稈，料水比（m/m）為1∶1.2，攪拌均勻后于35℃發(fā)酵48 h，60℃烘干，得到玉米秸稈發(fā)酵飼料。

1.9 數(shù)據(jù)處理

所有實驗均測定三次，取平均值，采用Excel軟件進行數(shù)據(jù)分析并用Origin軟件作圖。

2 結果與討論

2.1 機械預處理對玉米秸稈粒徑分布變化的影響

干燥、切碎的粗玉米秸稈顆粒大小約0.5 cm，經不同的機械預處理后，顆粒尺寸減小達到微米級，其粒徑分布見圖1。從圖1可以看出，玉米秸稈經機械預處理后粒徑明顯變小，經錘式粉碎的玉米秸稈顆粒大小集中分布在150～1 000 μm之間。球磨處理后的玉米秸稈其粒徑較小且最為均勻，約90%集中在10～100 μm之間，由于細小顆粒具有聚集性，因此測得的球磨顆?？赡鼙葘嶋H值偏大[11]。通過機械預處理后，玉米秸稈的粒徑減小、比表面積增大、酶的可及性增加，理論上可以提高酶水解的效率。同時，由于粒徑減小，玉米秸稈對消化道的刺激降低，適口性提高。

圖1 不同機械預處理方式下玉米秸稈樣品的粒徑分布Fig.1 Particle size distributions of corn straw samples milled with different types of mills

2.2 機械預處理對玉米秸稈化學結構的影響

機械處理對玉米秸稈NDF，ADF和可溶性總糖質量分數(shù)的影響見圖2。通過比較圖2中不同機械處理方式下NDF和ADF質量分數(shù)的變化發(fā)現(xiàn)，錘式粉碎秸稈NDF和ADF質量分數(shù)基本不變，而球磨處理的玉米秸稈NDF和ADF質量分數(shù)均降低，NDF質量分數(shù)下降1.3%，ADF質量分數(shù)下降3.5%，同時其可溶性總糖質量分數(shù)增加1.6%，小于ADF的減小量。ADF質量分數(shù)的下降可能是由于玉米秸稈經球磨處理后，纖維素分子斷裂，結晶結構破壞，使得原先因包含在纖維素分子鏈間而未被酸性洗滌劑水解的半纖維素暴露，進而在酸性條件下充分溶解；同時推測這些暴露的半纖維素在粉碎過程中部分因受到機械力作用被剪切，使得單糖或寡聚糖從多糖分子鏈上脫落，從而導致可溶性總糖增加。

圖2 不同預處理方式對玉米秸稈樣品中NDF、ADF和水溶性總糖質量分數(shù)變化的影響Fig.2 Effect of different treatment on the NDF，ADF and total soluble sugar content of corn straw

為驗證以上推論，對不同機械處理玉米秸稈可溶性總糖的單糖組成進行分析，結果見表1。從表1可以看出，各單糖組分質量分數(shù)隨玉米秸稈粒徑的減小而升高，且葡萄糖的增加量僅占總糖增加量的43%。由于半纖維素的主鏈主要由三類聚合物組成：即聚木糖類，聚葡萄糖-甘露糖類和聚半乳糖葡萄甘露糖類[12]，而構成這些聚合物的單體主要有木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖，4-O-甲基-D-葡萄糖醛酸基，半乳糖醛酸和葡糖糖醛酸等，以及少量的鼠李糖，巖藻糖等[13]。因此根據(jù)表1的單糖組成和變化可以進一步證明：玉米秸稈經球磨處理后增加的可溶性糖主要來自于半纖維素和纖維素的分子斷裂。

表1 可溶性總糖的單糖組成Table 1 Monose composition of the total soluble sugar

2.3 球磨預處理對玉米秸稈纖維素酶和木聚糖酶酶解效率的影響

圖3為用木聚糖酶和纖維素酶分別處理球磨前后玉米秸稈的可溶性總糖及部分還原糖變化情況。玉米秸稈經酶解處理后，其可溶性總糖和還原糖質量分數(shù)分別增加3.3倍和9.7倍。從2.2的分析可知，玉米秸稈經機械處理后，增加的可溶性總糖主要來自于半纖維素，再通過圖3比較酶解前后糖組成變化情況可以發(fā)現(xiàn)，酶解后玉米秸稈增加的可溶性糖基本都為還原糖，其中葡萄糖和纖維二糖增加量較木糖、阿拉伯糖和木二糖的增加量大，可以推測纖維素的降解量大于半纖維素。纖維素酶酶解效果好是因為球磨預處理后的玉米秸稈木質素剝離，纖維素在力的作用下斷裂，分為未被破壞的結晶區(qū)即抗水解部分和非結晶區(qū)即易水解部分[14]。顯然，粉碎后的玉米秸稈其纖維素的結晶度越低，酶解效越高。玉米秸稈在球磨過程中，受到擠壓力，剪切力和沖擊力等多重作用力，纖維素分子間氫鍵斷裂，無定形的結晶結構被破壞，同時由于玉米秸稈顆粒粒徑減小，可接觸及易受酶解的面積增加，因此酶解作用效果更好[15]，而機械處理后部分半纖維素分子仍包裹在纖維素中，導致木聚糖酶解作用效果相對較差；同時，半纖維素的支鏈較多，由于側鏈取代物會影響木聚糖酶的活性，因此木聚糖酶酶解效果也會受到影響[16]。

圖3 球磨預處理對玉米秸稈樣品酶解后可溶性總糖及還原糖釋放的影響Fig.3 Effect of ball milling pretreatment on the release of the total soluble sugar and total soluble sugar by enzymes of corn straw

2.4 微生物發(fā)酵對球磨預處理秸稈飼用品質提升的影響

利用乳酸片球菌R30對玉米秸稈原樣以及球磨玉米秸稈進行固態(tài)發(fā)酵，比較發(fā)酵前后玉米秸稈ADF和NDF含量的變化情況，結果見表2。由于ADF包含木質素和纖維素，NDF包含木質素，纖維素和半纖維素[17]，因此根據(jù)表2可知，球磨處理的玉米秸稈經發(fā)酵后纖維素質量分數(shù)下降9.1%，半纖維素質量分數(shù)下降4.9%，而未經球磨處理的玉米秸稈發(fā)酵后纖維素、半纖維素質量分數(shù)分別下降6.5%和3.9%。作為細胞壁的主要成分，纖維質量分數(shù)越低越有有利于提高胞內營養(yǎng)物質的利用率，降低單胃動物在消化過程中的能量消耗。

圖4為球磨玉米秸稈經固態(tài)發(fā)酵后其可溶性總糖及部分糖組分質量分數(shù)的變化情況，結合圖3分析得出，秸稈在木聚糖酶和纖維素酶的共同作用下，固態(tài)發(fā)酵過程中釋放出木糖，葡萄糖和纖維二糖等單糖和二糖，可利用的代謝糖質量分數(shù)增加，這些糖類能夠直接進入動物代謝循環(huán)中，從而顯著提高玉米秸稈的代謝能值。同時，部分糖類在發(fā)酵過程中可被有益微生物用于生長代謝，產生乳酸等有益代謝產物。

表2 發(fā)酵前后玉米秸稈ADF及NDF質量分數(shù)變化Table 2 Changes of ADF and NDF content of the corn straw after fermentation

圖4 發(fā)酵后可溶性糖及部分糖質量分數(shù)的變化Fig.4 Changes of soluble sugar content and some simple sugar content after fermentation

球磨處理前后的玉米秸稈經固態(tài)發(fā)酵后其產酸情況見圖5。發(fā)酵48 h后，玉米秸稈pH值下降，總酸質量分數(shù)升高，未經球磨處理的玉米秸稈原樣發(fā)酵后總酸質量分數(shù)為13.9 mg/g，發(fā)酵球磨玉米秸稈總酸質量分數(shù)達到26.3 mg/g，是前者總酸質量分數(shù)的1.9倍，而如果直接采用大小為2～3 cm的玉米秸稈接種乳酸菌進行青貯發(fā)酵，要達到相近的總酸濃度發(fā)酵周期長達20 d[18]。由于乳酸片球菌R30在發(fā)酵過程中可利用多種糖產酸，如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、氨基葡萄糖和纖維二糖等，且不存在葡萄糖阻遏效應，因此，在固態(tài)發(fā)酵過程中乳酸菌可利用的碳源質量分數(shù)越高越有利于產酸。有機酸作為有益代謝產物具有廣泛的功能，如延長飼料貯存期，提高飼料的適口性和采食量以及替代抗生素抑制腸道病原菌的生長[19]。此外經發(fā)酵的球磨玉米秸稈，其乳酸菌含量可達到1.5×109CFU/g，飼料中含有較多的活菌可以有效改善腸道中的微生物群系，從而有利于維持腸道環(huán)境的穩(wěn)定以及促進營養(yǎng)物質的分解[20]。

圖5 固態(tài)發(fā)酵后總酸質量分數(shù)和pH的變化Fig.5 Changes of pH value and total acid content after solid-fermentation

3 結語

玉米秸稈經機械活化后，顆粒直徑變小，比表面積增大。球磨處理的玉米秸稈可溶性碳水化合物的釋放量提高2.0倍；用纖維素酶和木聚糖酶酶解處理之后發(fā)現(xiàn)，球磨處理的玉米秸稈樣品可溶性總糖質量分數(shù)增加3.3倍，還原糖質量分數(shù)增加9.7倍。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，隨著玉米秸稈粒徑的減小，ADF質量分數(shù)下降，可溶性總糖的單糖組成質量分數(shù)增加，以上結果都充分證明，玉米秸稈經球磨預處理后，不僅顆粒變小，而且其原有結構改變，木質素這一天然屏障被破壞，共價鍵斷裂，使得原先包含在木質素中的部分纖維素和半纖維素在機械力的作用下暴露出來，易被酶降解或被直接剪切成小分子的可溶性碳水化合物，因此將球磨預處理與酶處理結合應用于乳酸菌固態(tài)發(fā)酵，有利于提升玉米秸稈營養(yǎng)價值，減少粗纖維等抗營養(yǎng)因子，增加動物可直接代謝的單糖和二糖含量，代謝能值提高；并且部分單糖和二糖在有益乳酸菌的作用下，高效轉化為有益代謝產物：揮發(fā)性有機酸，提高了玉米秸稈的適口性；同時乳酸菌得到有效增殖，對動物生長，免疫性能有益，為實現(xiàn)發(fā)酵玉米秸稈替代部分飼料用糧提供了參考依據(jù)。

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