“靈巴菌質(zhì)”抗腫瘤活性部位的體外篩選

尚文斌， 孫 鈺， 潘稚云， 潘 揚(yáng)

（南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210029）

因巴豆毒性較大，內(nèi)服須炮制后（巴豆霜）入藥［17］。在前期工作中，我們采用靈芝菌Ganoderma lucidum（Curtis：Fr.） P.Karst.對巴豆進(jìn)行獨(dú)特的發(fā)酵法炮制，得到其固體發(fā)酵產(chǎn)物——“靈巴菌質(zhì)”。研究表明，“靈巴菌質(zhì)”的毒性成分脂肪油和總蛋白的含量已明顯降低，這二種物質(zhì)含量均低于生巴豆及傳統(tǒng)炮制品（巴豆霜）［18］；進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，“靈巴菌質(zhì)”的毒性也有了明顯的下降，且低于巴豆霜［19］。

通過體外培養(yǎng)和MTT比色法，考察“靈巴菌質(zhì)”的提取物石油醚部位（PEE）、堿性醇提物（AME）和巴 豆 苷 （Cro） 對 SMMC-7721、MGC-803、A549、HepG-2腫瘤細(xì)胞增殖的影響，初步篩選這3種物質(zhì)的抗腫瘤活性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

DMSO：PCR級；低熔點(diǎn)瓊脂糖：生工生物工程股份有限公司；噻唑藍(lán)/MTT：上海捷瑞生物工程有限公司；胰酶：美國Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基：美國Life Technologies；其余試劑包括DMSO、甲醇、石油醚、乙腈等均為分析純或色譜純級，水為重蒸餾水。

HF 90二氧化碳培養(yǎng)箱，HF Safe 1200生物安全柜：上海力康生物醫(yī)療科技控股有限公司；Leica DM IL LED/DFC450倒置顯微鏡：德國徠卡儀器有限公司；Hitachi Corona MTP-601F全自動(dòng)熒光酶標(biāo)儀：日本日立公司；Sartorius BS 124S電子天平：0.1 mg，德國賽多利斯公司；手動(dòng)移液器：德國Eppendorf公司。

1.2 化學(xué)對照品、瘤株與藥品

巴豆苷：由本校凌云博士惠贈(zèng)（成都普思生物科技有限公司，HPLC面積歸一化法測定，其純度≥98.5%）；生巴豆：購自亳州輝睿中藥科技有限公司，經(jīng)潘揚(yáng)教授鑒定為中藥巴豆為大戟科植物巴豆Croton tiglium L.的干燥成熟果實(shí)；靈巴菌質(zhì)（LBJZ）：由作者所在實(shí)驗(yàn)室提供，制備方法參見文獻(xiàn)［8］；人肝癌SMMC-7721細(xì)胞和 HepG-2細(xì)胞、人胃癌MGC-803、人肺癌A549細(xì)胞：均由南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所惠贈(zèng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 “靈巴菌質(zhì)”石油醚提取部位、堿性醇提物的制備 取靈巴菌質(zhì)940 g，粉碎，過40目篩，以石油醚、二氯甲烷、水飽和正丁醇和甲醇四個(gè)極性梯度依次進(jìn)行索氏抽提12 h，提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將溶劑揮盡后，60℃減壓干燥成干浸膏，分別得石油醚、二氯甲烷、正丁醇和甲醇提取物各 150、17、7、50 g；其中石油醚即為石油醚部位 （petroleum ether extracts，PEE）。甲醇提取物用10%鹽酸1 000 mL超聲輔以攪拌1 h使溶解，過濾，濾液以10%氫氧化鈉溶液調(diào)pH 9～10，再以4 000 mL正丁醇分3～5次進(jìn)行萃取，合并萃取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓將溶劑揮盡后，60℃減壓干燥成干浸膏，即得堿性醇提物（AME）約14 g。 PEE、AME均用DMSO 溶解成儲(chǔ)備液備用，臨用時(shí)以培養(yǎng)液稀釋成所需濃度。

1.3.2 瘤株細(xì)胞的培養(yǎng) 將SMMC-7721、HepG-2、A549、MGC-803細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，DMEM培養(yǎng)基含胎牛血清1 00 ml/L，青霉素100 kU/L和鏈霉素100 mg/L，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱，相對飽和濕度的條件下培養(yǎng)。細(xì)胞長滿后，棄去培養(yǎng)液，用PBS輕輕洗滌2次，加入0.25%胰酶-0.02%EDTA，37℃消化3～5 min，每兩天按1∶3比例傳代1次，均取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 MTT比色法測定 消化收集對數(shù)增殖期細(xì)胞并調(diào)整成濃度5×107/L的細(xì)胞懸液，接種于96孔板，每孔100 μL，鏡下觀察確認(rèn)細(xì)胞貼壁良好時(shí)，加入含不同質(zhì)量濃度PEE、AME的培養(yǎng)液，使終質(zhì)量濃度依次為 25、50、100、200 mg/L；對照品 Cro 終質(zhì)量濃度依次為 100、200、350、500 μmol/L，以不含藥物的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞（含相同濃度的溶劑）作為空白對照，以培養(yǎng)基作為空白孔調(diào)零組，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞和藥物在37℃飽和濕度，體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中分別孵育24 h和48 h后，每孔加入 20 μL MTT （5 g/L），37 ℃繼續(xù)孵育 4 h， 終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)上清培養(yǎng)液，每孔加入200 μL DMSO，振蕩混勻10 min，使結(jié)晶物充分溶解。選擇490 nm波長，在酶標(biāo)儀上測定各孔光密度（optical density，OD）值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，按照下列公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率（IR，%）：

2 結(jié)果與討論

2.1 PEE對4種腫瘤細(xì)胞的增殖的影響

1）對SMMC-7721細(xì)胞的增殖的影響很小，可以忽略不計(jì)；

另一方面，智能家居產(chǎn)品也提供了一種新型的早教形式。近兩年，智能家居產(chǎn)品在科技的推動(dòng)下逐漸滲透至年輕家庭生活的方方面面，其中母嬰親子類智能家居產(chǎn)品不僅能提供母嬰知識(shí)，還能幫助寶寶學(xué)習(xí)知識(shí)，進(jìn)行簡單早教，因此廣受歡迎。各類產(chǎn)品中最受追捧的智能家居產(chǎn)品是智能電視，家庭擁有比例為51%，遠(yuǎn)高于智能體重秤、智能可穿戴設(shè)備等其他智能產(chǎn)品。

2）對HepG-2細(xì)胞的增殖有明顯的促進(jìn)作用，質(zhì)量濃度在100 mg/L時(shí)對HepG-2細(xì)胞在48 h的增殖促進(jìn)率高達(dá)53.6%，與正常對照組比較均有極顯著差異（P＜0.001）；

3）對MGC-803細(xì)胞的增殖有抑制作用，最高質(zhì)量濃度抑制率僅為22.1%，沒有實(shí)質(zhì)性意義。

4）與正常組對照比較，隨著的作用質(zhì)量濃度增加和作用時(shí)間的延長，其對A549細(xì)胞生長的抑制率也明顯增加，在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴性，100 mg/L藥物作用A549細(xì)胞48 h后，抑制率達(dá)76.3%；200 mg/L作用A549細(xì)胞48 h后，抑制率分別高達(dá)81.4%。各濃度組在不同時(shí)間點(diǎn)比較差異均有極顯著差異（P＜0.001），結(jié)果見圖1。

2.2 AME對4種腫瘤細(xì)胞增殖的影響

1）對SMMC-7721細(xì)胞的增殖有一定的抑制作用，質(zhì)量濃度在100 mg/L和200 mg/L是抑制率分別為31.7%和38.9%，與正常對照組比較有顯著性差異（P＜0.05）；

圖1 PEE作用48 h后對腫瘤細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effects on tumor cell proliferation after treatment with PEE for 48 h

2）質(zhì)量濃度在100 mg/L時(shí)，作用48 h后對HepG-2細(xì)胞增殖的促進(jìn)率高達(dá)62.3%，與正常對照組比較均有極顯著差異（P＜0.001）；

3）對MGC-803細(xì)胞增殖作用有一定的抑制作用，但作用不明顯，與正常對照比較沒有顯著性差異。

4）隨著作用質(zhì)量濃度增加和作用時(shí)間的延長，其對A549細(xì)胞生長的抑制率也明顯增加，在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴性和時(shí)間依賴性；與空白組相比較，在50、100、200 mg/L作用48 h后的抑制率均有極顯著差異（P＜0.001），最大質(zhì)量濃度200 mg/L組在48 h的抑制率分別達(dá)67.78%，結(jié)果見圖2。

圖2 AME作用48 h后對腫瘤細(xì)胞增殖作用影響Fig.2 Effects on tumor cell proliferation after treatment with AME for 48 h

2.3 Cro對A549細(xì)胞增殖的影響

與空白對照組相比，隨著的作用質(zhì)量濃度增加和作用時(shí)間的延長，Cro對A549細(xì)胞生長的抑制率也明顯增加，在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴性和時(shí)間依賴性，藥物作用A549細(xì)胞48 h后的抑制率均明顯高于相應(yīng)濃度藥物作用于A549細(xì)胞24 h后的抑制率，350 μmol/L藥物作用A549細(xì)胞24 h和48 h后，抑制率分別為42.75% 和62.73%，500 μmol/L作用A549細(xì)胞24 h和48 h后，抑制率分別高達(dá)56.85%和72.0%，以上兩組與空白對照組相比均有極顯著性差異（P＜0.001），結(jié)果見圖3。

圖3 Cro作用48 h后對A549腫瘤細(xì)胞增殖作用影響Fig.3 Effects on A549 tumor cell proliferation after treatment with Cro for 48 h

3 結(jié)語

將 “靈巴菌質(zhì)”分為石油醚、二氯甲烷、正丁醇和堿性甲醇提取物四個(gè)部位，由于石油醚（PEE）和堿性甲醇提取物（AME）得量相對較大，因此，首先對這兩個(gè)提取部位進(jìn)行了抗腫瘤活性的篩選，今后將對另外兩個(gè)提取部位的藥理作用繼續(xù)進(jìn)行探索。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PEE和AME對SMMC-7721、MGC-803、A549、HepG-2等4種不同的腫瘤細(xì)胞增殖產(chǎn)生不同的效應(yīng)，有抑制增殖作用；但也有促進(jìn)增殖作用；與巴豆的有效成分巴豆苷一樣，PEE和AME對肺癌A549細(xì)胞生長均呈現(xiàn)出明顯的抑制作用。

“靈巴菌質(zhì)”的不同提取物對腫瘤細(xì)胞的抑制作用以及不同的效應(yīng)可能與其活性組分有關(guān)。前期研究發(fā)現(xiàn)，PEE部分主要為低極性的巴豆脂肪油，甲酯化后經(jīng)GC-MS法分析結(jié)果表明，“靈巴菌質(zhì)”與生巴豆及其炮制品相比，無論在脂肪油成分種類還是相對含量上均存在一定差異［18］。AME部分則為極性較大的成分，除主要含有巴豆苷外，也含有巴豆三氮唑苷（crotonotriazole nucleotide），在炮制品巴豆霜中也發(fā)現(xiàn)存在此成分，而生巴豆中則沒有［20］，說明巴豆發(fā)酵與炮制物質(zhì)基礎(chǔ)類同。巴豆三氮唑苷是前期對“靈巴菌質(zhì)”化學(xué)成分進(jìn)行分離時(shí)，在正丁醇提取部位得到一個(gè)新化合物，通過UV、IR、1H NMR、13C NMR、2D NMR和MS確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)式，化學(xué)名為：1-b-D-呋喃核糖-6-氨基-1，2，3-三氮唑并 [5，4-d]吡啶 （1-b-D-ribofuranose-6-amino-1，2，3-triazolo[5，4-d]pyridine）。 對巴豆三氮唑苷的藥理活性進(jìn)行初步研究，發(fā)現(xiàn)其有一定的抗病毒活性，但并沒有抑瘤效果，提示AME的抗腫瘤效應(yīng)與巴豆三氮唑苷無關(guān)，而與巴豆苷相關(guān)。

此外，腫瘤細(xì)胞具有相同的病理機(jī)制和表型，又具有不同的病理特點(diǎn)和組織特異性，決定其對抗腫瘤藥物的敏感性的差異［21］。本研究中PEE和AME抗腫瘤作用的選擇性，說明兩者具有不同的腫瘤抑制效應(yīng)。今后需從活性組分分析和腫瘤細(xì)胞的不同分子靶點(diǎn)的角度進(jìn)一步開展研究。

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