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    降膽固醇乳酸菌的篩選及其對小白鼠的不良影響

    2014-12-25 02:28:54張開屏田建軍
    關(guān)鍵詞:菌液灌胃乳酸菌

    張開屏, 田建軍

    (1.內(nèi)蒙古商貿(mào)職業(yè)學(xué)院 食品工程系,內(nèi)蒙古 呼和浩特010070;2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

    乳酸菌是人體腸道中重要的益生菌,對維持宿主的微生態(tài)平衡和提高免疫功能起著極其重要的作用[1-3]。國外大量研究證實(shí)[4-7],不同種類的乳酸菌具有降低膽固醇的效果。服用乳酸菌及其相關(guān)制品,可降低心血管病的發(fā)病率。因此從傳統(tǒng)發(fā)酵制品中篩選出安全高效的降膽固醇乳酸菌,可為今后益生菌制劑和功能性乳制品開發(fā)提供優(yōu)良菌種。

    作者以分離自內(nèi)蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中14株乳酸桿菌為研究對象,從中篩選出具有降膽固醇能力較高的乳酸菌,并進(jìn)行了乳酸菌種的鑒定和灌胃小白鼠的不良影響試驗(yàn)。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    分離自內(nèi)蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中乳酸菌14株。TPY培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、MRS-CHOL培養(yǎng)基:參照文獻(xiàn)[12]進(jìn)行配制;膽固醇、鄰苯二甲醛,巰基乙酸鈉、正己烷、冰醋酸:均為分析純;16S rDNA基因序列分析材料:參照文獻(xiàn)[14]進(jìn)行配制;清潔級(jí)純系昆明種小鼠:體重(20±2)g,雌雄各半,由內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供,許可證號(hào):SCXK(蒙2002-0001)。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 供試菌液的調(diào)制 參照文獻(xiàn)[11],對試驗(yàn)菌株進(jìn)行純化和革蘭氏染色鏡檢,MRS液體培養(yǎng)基37℃、24 h活化2代,按1%接種體積分?jǐn)?shù)接種MRS三角瓶液體培養(yǎng)(約 120 mL、37 ℃、24 h)然后無菌分裝于三支離心管中(約40 mL),按3 000 r/min離心10 min,棄上清液加滅菌生理鹽水約30 mL洗滌3次,按3 000 r/min離心10 min,棄上清液,獲得菌體細(xì)胞,再加20~30 mL滅菌生理鹽水,分光光度計(jì)調(diào)供試菌液活菌數(shù)約為3×109CFU/mL。

    1.2.2 膽固醇的測定

    1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:分析天平精確稱量分析純膽固醇 50.00 mg,參照文獻(xiàn)[9,14],用無水乙醇定容于50 mL的容量瓶中,配成質(zhì)量濃度為1.0 g/L的膽固醇標(biāo)液。 精確吸取 0.50、1.00、1.50、2.00、2.50 mL的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)液于50 mL容量瓶中,無水乙醇定容, 得到 10.0,20.0,30.0,40.0,50.0 mg/L 的梯度溶液。分別取梯度溶液1.0 mL置于20 mL試管中,在通風(fēng)廚中抽干,然后加入2.0 mL鄰苯二甲醛溶液,磁力攪拌器振蕩使其充分溶解,10 min后加入1.0 mL的濃H2SO4磁力攪拌器振蕩混合均勻,室溫條件下放置10 min使其顯色,波長550 nm條件下測其OD值,分光光度計(jì)用2.0 mL鄰苯二甲醛溶液加入1.0 mL的濃H2SO4,混合均勻,室溫放置10 min調(diào)零。以膽固醇質(zhì)量百分比濃度為縱坐標(biāo),550 nm條件下測的OD值為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,見圖1。

    圖1 膽固醇質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of cholesterol concentration

    2)樣品處理及測定:參照文獻(xiàn)[12],按1%的接種體積分?jǐn)?shù)將供試菌液在MRS-CHOL培養(yǎng)基中37℃厭氧培養(yǎng)24 h后,3 000 r/min離心10 min,取上清液為待測樣品,參照文獻(xiàn)[9-10,14],取待測試驗(yàn)樣品0.5 mL,加無水乙醇3.0 mL和50%KOH 2.0 mL振蕩器混合均勻,60℃水浴恒溫10 min,冷卻后加正己烷5.0 mL,混合均勻,加雙蒸水3.0 mL后再充分混合,室溫靜置15 min使溶液分層,取正己烷層溶液2.0 mL抽干,加入鄰苯二甲醛溶液2.0 mL,室溫靜置10 min,加入1.0 mL濃H2SO4,混合均勻,放置10 min后,550 nm條件下測OD值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算樣品中膽固醇的質(zhì)量濃度,進(jìn)而計(jì)算膽固醇降解率R及其單位菌株對膽固醇的去除效力E。

    式中:S對照為對照樣上清液中膽固醇質(zhì)量濃度(μg/mL);S接種為發(fā)酵上清液中膽固醇質(zhì)量濃度(μg/mL);N 為乳酸菌數(shù)的對數(shù)值 lg(CFU/g)。

    1.2.3 乳酸菌的生理生化試驗(yàn) 對篩選到的菌株進(jìn)行革蘭氏染色,在生物顯微鏡下觀察菌體形態(tài),通過氧化氫酶試驗(yàn)、運(yùn)動(dòng)性及產(chǎn)酸、產(chǎn)氣、糖發(fā)酵等生理生化試驗(yàn)進(jìn)行鑒定[15]。

    參照文獻(xiàn)[11、13、16],采用通用的 16S rDNA 引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到約1 500 bp的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物,電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物后,送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序,進(jìn)而對乳酸菌進(jìn)行種的鑒定。

    1.2.4 菌株N59-1的致病性試驗(yàn)

    1)試驗(yàn)小鼠分組及給藥:將40只試驗(yàn)小白鼠隨機(jī)分為兩組,雄雌各半,每組20只,其中一組用于空白對照。以約3×109CFU/mL菌液分別灌胃雌雄小鼠,每次每只小鼠灌胃1.0 mL,在24 h內(nèi)灌胃2次,間隔8 h,取另一管用滅菌脫脂乳制備成相同濃度的菌懸液,空白對照組小鼠每次每只小鼠灌胃1.0 mL脫脂乳培養(yǎng)基,灌胃時(shí)間與試驗(yàn)組相同,連續(xù)觀察30 d,記錄觀察期間小鼠表現(xiàn)和死亡情況。

    2)小鼠死亡記錄及組織切片的制作:參照文獻(xiàn)[17],對死亡的小鼠進(jìn)一步做臟器有無病理變化試驗(yàn)和主要器官心、肝、腎、脾、賁門的組織切片觀察。若小鼠沒有死亡,試驗(yàn)結(jié)束時(shí),則從每組中各取一只小鼠,對小白鼠進(jìn)行摘眼球取血,制備血片,將取血后的小白鼠脫臼致死,進(jìn)行組織切片觀察。

    3)臟器系數(shù)的測定[18]:取血完畢脫臼處死小鼠,并小心分離出肝、腎,并立即于分析天平上稱量質(zhì)量,計(jì)算臟器系數(shù)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 降膽固醇乳酸菌的篩選

    按1%的接種體積分?jǐn)?shù),將供試菌液接種于MRS-CHOL培養(yǎng)基中,與對照樣一起在厭氧條件下,37℃培養(yǎng)24 h,分別測定其pH值、培養(yǎng)基中膽固醇的質(zhì)量濃度,并分別計(jì)算單位菌株對膽固醇的去除效力E和膽固醇降解率R,結(jié)果見圖2~3。圖中帶有相同子母,表示樣品之間差異不顯著(P>0.05),不同子母表示樣品之間差異顯著(P<0.05)。

    由圖2可以看出 ,14株全部試驗(yàn)菌株對介質(zhì)中膽固醇都有脫除作用,除12和13號(hào)菌株外,其它12株菌株與對照樣相比差異顯著(P<0.05)。試驗(yàn)菌株對膽固醇的脫除力平均值為6.63 μg/lg(CFU/g),脫除力高于平均6.63 μg/lg(CFU/g)的菌株有7株,代號(hào)分別為 2、4、5、6、7、9、11,其中 11 號(hào)菌株 N59-1 對膽固醇的脫除力為 14.85 μg/lg(CFU/g),脫除力最高,代號(hào)15的菌株對膽固醇的脫除力與平均值相等,脫除力低于平均值 6.63 μg/lg(CFU/g)的菌株有 6 株,代號(hào)分別為 3、8、10、12、13、14。 菌株間對膽固醇脫除力的差異顯著性,如圖2中子母所示,含有不同子母,表示差異顯著(P<0.05)。

    圖2 乳酸菌對膽固醇的脫除效力Fig.2 Cholesterol removal effectiveness of lactobacillus from media

    由圖3可以看出,14株全部試驗(yàn)菌株對介質(zhì)中膽固醇都有一定的降解作用,除12和13號(hào)菌株外,其它12株菌株與對照樣1相比差異顯著 (P<0.05)。試驗(yàn)菌株對膽固醇的降解率平均值為15.48%,降解率高于平均值15.48%的菌株有7株,代 號(hào) 分 別 為 4、5、6、7、9、11、15, 其 中 11 號(hào) 菌 株N59-1對膽固醇的降解率為42.97%,降解率最高,降解率低于平均值15.48%的菌株有7株,代號(hào)分別為 2、3、8、10、12、13、14。 菌株間對膽固醇降解率的差異顯著性,如圖3中子母所示,含有不同子母,表示差異顯著(P<0.05)。

    結(jié)合圖2和圖3可以看出,菌株對膽固醇的脫除力和菌株對膽固醇的降解率有高度的相關(guān)性,降解率高的菌株,脫除力也高,代號(hào)11的菌株N59-1,對膽固醇的去除率R高達(dá)42.97%,同時(shí)單位菌株對膽固醇的去除效力E為14.85,與其它菌株相比差異顯著(P<0.05),故N59-1可作為比較理想的篩選菌株。

    圖3 乳酸菌對膽固醇的降解率Fig.3 Cholesterol removal rate of lactobacillus from media

    2.2 乳酸菌的生理生化鑒定

    2.2.1 乳桿菌屬的鑒定 采用嗜酸乳桿菌ATCC4356、保加利亞乳桿菌JCM1002和瑞士乳桿菌ATCC12278三株標(biāo)準(zhǔn)菌株作為對照菌株進(jìn)行乳桿菌屬的鑒定。經(jīng)形態(tài)學(xué)和生理生化試驗(yàn)對篩選的11號(hào)菌株N59-1進(jìn)行了鑒定,N59-1發(fā)酵葡萄糖但不產(chǎn)生氣體,屬同型乳酸發(fā)酵,細(xì)胞壁中不含有二氨基庚二酸,產(chǎn)生DL-乳酸,脫脂乳中產(chǎn)酸量為1.3%,試驗(yàn)結(jié)果見表1。根據(jù)表1及文獻(xiàn)[13],可將試驗(yàn)菌株鑒定為乳酸菌的乳桿菌屬。

    表1 乳桿菌的生理生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果Table 1 Consequence on identification Lactobacillus physiological and biochemical experiment

    2.2.2 乳桿菌種的鑒定 糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果見表2。由表2可以看出,N59-1均分解木糖、核糖、蔗糖、果糖、淀粉、乳糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、麥芽糖、纖維二糖等產(chǎn)酸,不利用肌醇、菊粉、七葉苷、扁桃苷、松三糖、纖維二糖。根據(jù)表2,參照文獻(xiàn)[4]可將N59-1歸為植物乳桿菌。

    表2 糖發(fā)酵試驗(yàn)Table 2 Capacity of strains to make use of carbon source

    用0.8 g/dL的瓊脂糖凝膠對試驗(yàn)菌株N59-1的16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物做電泳檢測,經(jīng)核酸染料染色后,在1 500 bp處出現(xiàn)熒光條帶,與預(yù)期一致,然后用回收的產(chǎn)物直接進(jìn)行16S rDNA序列測定。由菌株N59-1的16S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知的乳桿菌屬內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)菌株的16S rRNA/rDNA基因序列同源性百分比對比可知,菌株N59-1的16S rDNA序列與其它乳桿菌的16S rRNA/rDNA序列相似性均大于84%,是乳桿菌屬的菌株。而且菌株N59-1與L.plantarum的標(biāo)準(zhǔn)菌株的同源性為99.7%,可以認(rèn)為該菌株是一株Lb.plantarum。

    2.3 菌株N59-1的致病性試驗(yàn)

    2.3.1 菌株N59-1對小鼠急性毒性試驗(yàn)結(jié)果 以3×109CFU/mL濃度菌液分別灌胃雌雄小鼠,每次每只小鼠灌胃1.0 mL,在24 h內(nèi)灌胃2次,間隔8 h,觀察7 d,結(jié)果發(fā)現(xiàn)全部小鼠在整個(gè)試驗(yàn)過程中精神狀態(tài)、毛皮、膚色、飲水、進(jìn)食量、尿色和糞便與對照組小鼠的情況相同,均未發(fā)生任何不良反應(yīng)和死亡情況,表明試驗(yàn)菌株沒有引起小鼠的不良反應(yīng)。

    2.3.2 菌株N59-1對小鼠血液的影響 試驗(yàn)觀察期30 d時(shí),將每只小白鼠進(jìn)行摘眼球取血,制備血片。血片結(jié)果顯示,灌胃試驗(yàn)菌株的小白鼠與對照組的血片相似,細(xì)胞分布均勻,形態(tài)正常,無異常細(xì)胞,白細(xì)胞數(shù)量正常,沒有血小板和紅細(xì)胞聚集。

    2.3.3 菌株N59-1對小鼠重要器官組織形態(tài)學(xué)的影響 試驗(yàn)觀察期30 d時(shí),試驗(yàn)組小鼠肺臟、脾臟、腎臟、心臟與對照組相似。肝臟組織結(jié)構(gòu)正常,肝小葉結(jié)構(gòu)清楚;肺臟結(jié)構(gòu)形態(tài)正常,未見明顯的病理學(xué)改變;脾臟結(jié)構(gòu)形態(tài)正常,紅髓、白髓清楚可見,無增生,未見異常改變;腎臟皮質(zhì)、髓質(zhì)、腎小球結(jié)構(gòu)正常,腎小管上皮細(xì)胞無濁腫或脂肪變性;心臟部位心室、心房、心肌纖維結(jié)構(gòu)清楚,橫紋清晰可見,為正常結(jié)構(gòu),未見炎性細(xì)胞侵入,間質(zhì)未見異常。

    2.3.4 菌株N59-1對小鼠臟器系數(shù)的影響 給食含N59-1菌液30 d稱重后,處死小鼠解剖檢查心、肝、脾、肺、腎、腦、胃、腸等全身各臟器,肉眼觀察未發(fā)現(xiàn)明顯異常。取心、肝、肺、腎、脾等靶臟器,用濾紙吸去血液稱重,求臟器系數(shù),結(jié)果見表3。

    表3 菌株N59-1對小鼠臟器系數(shù)的影響(X±S,n=10)Table 3 Effect of strain N59-1 on organ coefficient in mice(X±S,n=10)

    由表3可知,小鼠心臟系數(shù)、肝臟系數(shù)、肺臟系數(shù)、脾臟系數(shù)、腎臟系數(shù)、腦系數(shù)、卵巢或睪丸系數(shù)試驗(yàn)組與對照組無顯著變化(P>0.05),可見含N59-1菌液對小鼠無不良影響。

    3 結(jié)語

    1)14株全部試驗(yàn)菌株對MRS-CHOL培養(yǎng)基中膽固醇都有一定的脫除作用,脫除率R在6.84%~42.97%之間,R的平均值為16.59%,其中12株菌株與對照樣相比差異顯著(P<0.05),菌株N59-1對膽固醇的脫除率最高,數(shù)值為42.97%(P<0.05)。

    2)菌株N59-1與標(biāo)準(zhǔn)菌株L.plantarum的同源性約為99.7%,菌株N59-1可判定為L.plantarum。

    3)在30 d的灌胃期內(nèi),菌株N59-1在行為、血液和重要器官組織形態(tài)學(xué)、臟器系數(shù)方面,試驗(yàn)組與對照組無顯著差異(P>0.05),可見含N59-1菌液對小鼠無不良影響。

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