豬源益生枯草芽孢桿菌的分離鑒定及培養(yǎng)條件優(yōu)化

魏姍姍， 馬紅霞， 高云航， 幺乃全， 徐鳳宇， 李茂輝

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130118；2.吉林正大實(shí)業(yè)有限公司，吉林長(zhǎng)春 130052）

益生芽孢桿菌可產(chǎn)生脂肽、肽、磷脂、多烯、氨基酸、核酸等多種抑菌物質(zhì) （Tan等，2013；Chandraleka 和 Ramya，2011；呂艷艷等，2011），具有廣譜抑菌活性，且無(wú)毒、無(wú)副作用、無(wú)殘留、無(wú)耐藥性（Jacquet和 Grimal，2012；Huyghebaet等，2011）。 基于仔豬腹瀉的病原性細(xì)菌以革蘭氏陰性菌為主、發(fā)病率和死亡率較高的生產(chǎn)實(shí)際，本研究從健康仔豬腸道內(nèi)分離拮抗革蘭陰性菌的芽孢桿菌，經(jīng)抑菌試驗(yàn)，耐受人工胃、腸液試驗(yàn)和安全性試驗(yàn)，獲得了一株益生芽孢桿菌，為其生產(chǎn)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 解淀粉芽孢桿菌 （TR）、大腸桿菌（CVCC200）、大腸桿菌（AT52）、大腸桿菌（JMS）、金黃色葡萄球菌（K88）、白葡萄球菌（AK2）、恥垢分枝桿菌（mc2155）、新金分枝桿菌（NC18-1）、偶發(fā)分枝桿菌（NC19-2）、母牛分枝桿菌（NH55-2）、金新分枝桿菌（NC56-2）、黏質(zhì)沙雷菌（jn01）、鏈球菌（CVCC100）、多殺性巴氏桿菌（CVCC500）、多殺性巴氏桿菌（PmA），均為吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑 NaCl、MgSO4·7H2O、NH4H2PO4、檸檬酸鈉、酚紅、豬膽鹽、胃蛋白酶、胰蛋白酶、KH2PO4、NaOH、10%鹽酸，均購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司；DNA凝膠回收純化試劑盒，購(gòu)自北京鼎國(guó)生物有限責(zé)任公司；質(zhì)粒小提試劑盒，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。人工胃液和人工腸液配制參考曹鈺等（2006），略有改動(dòng)。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB固體、LB液體培養(yǎng)基和檸檬酸鹽培養(yǎng)基按常規(guī)方法配制（周德慶，1986）。

1.1.4 試驗(yàn)動(dòng)物 體重17～20 g的昆明系小鼠20只，購(gòu)自長(zhǎng)春生物制品研究所有限責(zé)任公司，20日齡長(zhǎng)白杜洛克健康仔豬，購(gòu)自長(zhǎng)春市某豬場(chǎng)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的分離 采集健康仔豬的空腸，置于裝有5 mL無(wú)菌生理鹽水的試管中，80℃水浴作用10 min，靜置后吸上清100 μL涂于LB平板上，37℃培養(yǎng)至長(zhǎng)出菌落。

1.2.2 拮抗試驗(yàn) 將分離到的菌株點(diǎn)接法接種于涂有大腸桿菌 （CVCC200）和金黃色葡萄球菌（K88）的LB平板上，37℃培養(yǎng)12～14 h，觀察抑菌效果；取有抑菌作用的芽孢桿菌分別進(jìn)行37℃厭氧和有氧培養(yǎng)，觀察抑菌效果，若菌株無(wú)抑菌效果則舍去。

1.2.3 毒力試驗(yàn) 將抑菌效果較好的14株菌接種于液體LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h后，制備成濃度為1×109cfu/mL的菌液，腹腔注射試驗(yàn)鼠，1 mL/只，觀察小鼠生存狀況，若接種菌株的小鼠出現(xiàn)異常表現(xiàn)甚至死亡，則舍去該菌株。

1.2.4 抑菌譜試驗(yàn) 將毒力試驗(yàn)篩選出的菌株用點(diǎn)接法接種于涂有14種指示菌的平板上，觀察抑菌效果，若菌株抑菌譜相對(duì)較廣且抑菌效果較好，則保留該菌株。

1.2.5 耐膽鹽試驗(yàn) 將篩選到的有廣譜抑菌活性的菌株接種于含0%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%豬膽鹽的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)40、80、120 min，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

1.2.6 耐人工胃液、腸液試驗(yàn) 取已形成芽孢的分離菌培養(yǎng)物離心，用0.9%的生理鹽水洗滌兩次后重懸，接種于人工胃液中，振蕩混勻，37℃水浴孵育，每隔40 min取樣進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

將經(jīng)pH為2.0的人工胃液處理后的菌體離心，用0.9%生理鹽水洗滌兩次后重懸接種于人工腸液中，振蕩混勻，37℃水浴孵育，每隔40 min取樣1次進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

1.2.7 菌株JN-16的菌落及形態(tài)觀察 將耐受性和抑菌效果較好的菌株JN-16劃線接于LB固體培養(yǎng)基表面，37℃培養(yǎng)12～14 h，觀察菌落特征，經(jīng)革蘭染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察菌體的形態(tài)大小。

1.2.8 菌株JN-16的分子生物學(xué)鑒定 采用試劑盒法提取菌株JN-16基因組總DNA，應(yīng)用PCR法擴(kuò)增16S rDNA，反應(yīng)體系見表1。得到的PCR產(chǎn)物用DNA凝膠回收純化試劑盒純化并回收1400～1500 bp片段，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后送上海生物工程有限責(zé)任公司測(cè)序。將測(cè)序得到的16S rDNA全序列遞交 GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast比對(duì)及同源性比較，將與之同源性最高的15株細(xì)菌的16S rDNA序列采用DNAstar軟件進(jìn)行比對(duì)分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

表1 PCR反應(yīng)體系 μL

1.2.9 耐鹽試驗(yàn) 挑取菌株JN-16和解淀粉芽孢桿菌（TR）的單個(gè)菌落分別接種于含5%NaCl的LB液體培養(yǎng)基中，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，觀察結(jié)果。

1.2.10 檸檬酸鹽利用試驗(yàn) 分別釣取菌株JN-16和解淀粉芽孢桿菌（TR），將其單個(gè)菌落分別接種于檸檬酸鹽斜面培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)3 d，觀察結(jié)果。

1.3 抑菌培養(yǎng)條件優(yōu)化

1.3.1 最適培養(yǎng)時(shí)間及溫度 將菌株JN-16種子液按照5%（V/V）接于LB液體培養(yǎng)基中置于28、32、33、34、37 ℃培養(yǎng) 12、24、48、72 h 后，10000 r/min離心15 min，收集上清，采用牛津杯法分別檢測(cè)上清液對(duì)大腸桿菌（CVCC200）和金黃色葡萄球菌（K88）的抑菌效果，得到最適培養(yǎng)時(shí)間及溫度。

1.3.2 最適pH 將菌株JN-16種子液按照5%（V/V） 接于 pH 分別為 4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5、10.5的LB液體培養(yǎng)基中，33℃培養(yǎng)24 h，10000 r/min離心15 min，收集上清，采用牛津杯法分別檢測(cè)上清液對(duì)大腸桿菌（CVCC200）和金黃色葡萄球菌（K88）的抑菌效果，得到最適 pH。

1.3.3 碳源優(yōu)化 將菌株JN-16種子液按照5%（V/V）接種于分別以羧甲基纖維素鈉、馬鈴薯淀粉、葡萄糖、麩皮、秸稈、麥芽糖、乳糖、蔗糖作為碳源，pH為6.5的LB液體培養(yǎng)基中，33℃培養(yǎng)24 h，10000 r/min離心15 min，收集上清，采用牛津杯法分別檢測(cè)上清液對(duì)大腸桿菌（CVCC200）和金黃色葡萄球菌（K88）的抑菌效果。

1.3.4 氮源優(yōu)化 將菌株JN-16種子液按照5%（V/V）接種于分別以NH4Cl、牛肉膏、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、蛋白胨混合酵母粉、NH4Cl混合牛肉膏作為氮源，pH為6.5的LB液體培養(yǎng)基中，33℃培養(yǎng)24 h，采用牛津杯法分別檢測(cè)上清液對(duì)大腸桿菌（CVCC200）和金黃色葡萄球菌（K88）的抑菌效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離和拮抗試驗(yàn)結(jié)果 從仔豬空腸內(nèi)共篩選出芽孢桿菌23株，通過(guò)抑菌試驗(yàn)得到14株對(duì)大腸桿菌（CVCC200）和金黃色葡萄球菌（K88）抑制效果較好的菌株，并將它們命名為菌株JN-4、JN-8、JN-10、JN-11、JN-12、JN-13、JN-14、JN-15、JN-16、JN-17、JN-18、JN-19、JN-21、JN-22。

2.2 毒力試驗(yàn)結(jié)果 灌服菌株JN-14的小鼠死亡，其他小鼠精神狀況正常，未出現(xiàn)異常反應(yīng)，剖檢未見病變，這表明除菌株JN-14組外，其他13株菌株對(duì)試驗(yàn)小鼠無(wú)毒，所以可舍去菌株JN-14，將其他13株菌進(jìn)一步篩選。

2.3 抑菌譜試驗(yàn)結(jié)果 對(duì)毒力試驗(yàn)篩選出的13株菌株進(jìn)行抑菌譜測(cè)定，結(jié)果如表2所示。但13株菌株對(duì)白葡萄球菌（AK2）、鏈球菌（CVCC100）、大腸桿菌（JMS）、多殺性巴氏桿菌（CVCC500），多殺性巴氏桿菌（PmA）的抑菌能力較低，抑菌圈較小，對(duì)新金分枝桿菌 （NC18-1）、偶發(fā)分枝桿菌（NC19-2）、母牛分枝桿菌（NH55-2）均無(wú)抑制作用。 菌株JN-4、菌株JN-8、菌株JN-11、菌株JN-16、菌株JN-19抑菌譜較廣，且抑菌效果較好，所以保留該5株菌株并進(jìn)一步篩選。

2.4 耐膽鹽試驗(yàn)結(jié)果 豬小腸中膽鹽的高滲透壓環(huán)境不利于菌體存活，0.3%的膽鹽濃度被認(rèn)為是篩選抗性菌的參考標(biāo)準(zhǔn)。由圖1可見，菌株JN-16、菌株JN-8對(duì)一定濃度的膽鹽環(huán)境具有良好的耐受性，濃度為0.2%和0.3%膽鹽作用120 min后，仍可保持較高的存活率，當(dāng)膽鹽濃度達(dá)0.4%和 0.5%時(shí)，JN-8活菌數(shù)下降，而菌株JN-16對(duì)0.5%膽鹽至少可耐受120 min。

2.5 耐人工胃腸液試驗(yàn)結(jié)果

2.5.1 耐人工胃液試驗(yàn)結(jié)果 健康動(dòng)物的胃液pH一般為0.9～1.8，進(jìn)食后胃液的pH為1.8～5，食物在胃中消化的時(shí)間一般為1～2 h。因此，菌株要有很好的耐酸能力才能通過(guò)高酸的胃環(huán)境而到達(dá)小腸發(fā)揮作用。由表3可知，菌株JN-16和菌株JN-8均對(duì)人工胃液有較好的耐受性。

表2 抑菌試驗(yàn)結(jié)果 mm

圖1 不同膽鹽濃度和作用時(shí)間對(duì)菌株活菌數(shù)影響（108cfu/mL）

2.5.2 耐人工腸液試驗(yàn)結(jié)果 小腸液的pH一般為7.6，食物通過(guò)的時(shí)間為1.5 h，因此，菌株只有耐受住小腸液的作用，并保持一定數(shù)量才能發(fā)揮作用。由表4可知，人工腸液對(duì)JN-16號(hào)菌株影響小，大部分菌株均能夠在腸液中生長(zhǎng)，這說(shuō)明菌株JN-16對(duì)人工腸液的耐受能力最強(qiáng)。

表3 在不同培養(yǎng)時(shí)間下菌株在人工胃液中的存活情況 108cfu/mL

表4 在不同培養(yǎng)時(shí)間下菌株在人工腸液中的存活情況 108cfu/mL

2.6 菌株JN-16的菌落及個(gè)體形態(tài) 菌株JN-16菌落呈白色，扁平，半透明，邊緣不整齊；在液體培養(yǎng)基表面形成皺醭；菌體長(zhǎng)1.04～1.74 μm，革蘭陽(yáng)性，芽孢0.6～1.5 μm，橢圓，較菌體狹窄，位于菌體中央。

2.7 菌株JN-16的16S rDNA序列同源性分析以菌株JN-16基因組DNA為模板，利用細(xì)菌16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到特異性較高的唯一產(chǎn)物，大小為1500 bp左右，經(jīng)測(cè)序和序列分析發(fā)現(xiàn)，所獲得的DNA基因片段長(zhǎng)度為1488 bp，與枯草芽孢桿菌X-01（序列登錄號(hào)：EU723210.1）和解淀粉芽孢桿菌HY-7（序列登錄號(hào)：JN382250.1）等菌株存在100%的同源性。

2.8 菌株JN-16基因序列系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建結(jié)果 應(yīng)用DNAstar軟件，用測(cè)得序列和GenBank中收錄的同源性最高的15株芽孢桿菌的16S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖2。表明菌株JN-16與解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌親緣關(guān)系最近。

圖2 基于菌株16S rDNA序列的進(jìn)化樹

2.9 含5%NaCl的LB培養(yǎng)基的培養(yǎng)結(jié)果 由培養(yǎng)結(jié)果可以看出，菌株JN-16能夠在5%NaCl的LB的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。通過(guò)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》可知，枯草芽孢桿菌可在5%NaCl的LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)而解淀粉芽孢桿菌（TR）則不能在其中生長(zhǎng)，所以可初步認(rèn)為菌株JN-16為枯草芽孢桿菌。

2.10 檸檬酸鹽利用試驗(yàn)結(jié)果 將菌株JN-16和解淀粉芽孢桿菌分別接種于檸檬酸鹽斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3 d，培養(yǎng)基為堿性（指示劑為藍(lán)色或桃紅色）者為陽(yáng)性，否則為陰性。培養(yǎng)3 d后，觀察結(jié)果。菌株JN-16在檸檬酸鹽培養(yǎng)基上表現(xiàn)為陽(yáng)性，這與枯草芽孢桿菌的性質(zhì)相同。

2.11 抑菌培養(yǎng)條件優(yōu)化結(jié)果

2.11.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)JN-16抑菌作用的影響 由圖3可知，在發(fā)酵24 h時(shí)，菌株JN-16對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抑制作用相對(duì)其他發(fā)酵時(shí)間抑制效果好，抑菌圈直徑分別達(dá)到11 mm和12 mm。發(fā)酵時(shí)間在12 h和36 h，抑菌圈差異均不顯著。在發(fā)酵時(shí)間為72 h時(shí)，抑菌圈最小，由此可以看出，菌株JN-16對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制能力均較強(qiáng)，同時(shí)當(dāng)發(fā)酵時(shí)間達(dá)到24 h后，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，抑菌能力逐漸減弱。所以，獲得菌株JN-16的最適抑菌時(shí)間為24 h。

圖3 不同培養(yǎng)溫度對(duì)菌株JN-16抑菌作用的影響

2.11.2 溫度對(duì)JN-16抑菌作用的影響 由圖4可知，28～33℃，菌株JN-16抑菌能力隨溫度升高而增強(qiáng)，達(dá)到最大值后逐漸減弱。而菌株JN-16在發(fā)酵時(shí)間為33℃和37℃時(shí)抑菌圈大小相同，抑菌圈直徑為11 mm，較其他發(fā)酵溫度抑制大腸桿菌能力強(qiáng)。菌株JN-16對(duì)金黃色葡萄球菌最大抑制作用發(fā)生在發(fā)酵溫度為33℃時(shí)，抑菌圈直徑為12 mm。所以獲得菌株JN-16的最適抑菌溫度為33℃和37℃。

圖4 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株JN-16抑菌作用的影響

2.11.3 pH對(duì)JN-16抑菌作用的影響 由圖5可知，pH在達(dá)到6.5之前，抑制能力不斷增強(qiáng)，pH達(dá)到6.5時(shí)，抑制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的能力最大，抑菌圈直徑分別為20 mm和12.1 mm，隨后抑制能力逐漸減弱。不同pH值對(duì)JN-16抑制大腸桿菌能力影響較大，但對(duì)抑制金黃色葡萄球菌能力影響較小。

圖5 不同pH對(duì)菌株JN-16抑菌作用的影響

2.11.4 改變碳源對(duì)JN-16抑菌作用的影響 由圖6可知，以葡萄糖作為碳源時(shí)，JN-16抑制大腸桿菌能力最強(qiáng)，抑菌圈直徑為14.42 mm，乳糖、馬鈴薯粉、麥芽糖次之，抑制大腸桿菌能力最低的碳源是羧甲基纖維素鈉和蔗糖，抑菌圈直徑均為12.1 mm。抑制金黃色葡萄球菌能力最強(qiáng)的碳源是馬鈴薯淀粉，抑菌圈直徑為14 mm，羧甲基纖維素鈉、麩皮、葡萄糖、乳糖、秸稈次之，抑制金黃色葡萄球菌能力最低的是麥芽糖，抑菌圈直徑為11.7 mm。由于葡萄糖抑菌效果較好，價(jià)格低廉，故選葡萄糖為最佳碳源。

圖6 不同碳源對(duì)菌株JN-16抑菌作用的影響

2.11.5 改變氮源對(duì)抑菌作用的影響 由圖7所示，作為菌株JN-16抑制大腸桿菌能力最強(qiáng)的氮源是牛肉膏，抑菌圈直徑為11.48 mm，其次為大豆蛋白胨和NH4Cl，抑菌圈直徑分別為11.3 mm和11.1 mm，蛋白胨+酵母粉作為氮源抑菌能力最低，抑菌圈直徑為10.4 mm。NH4Cl+牛肉膏和胰蛋白胨作為氮源，抑菌圈直徑為10.8 mm和10.7 mm，差異不顯著。NH4Cl和大豆蛋白胨作為氮源，JN-16抑制金黃色葡萄球菌能力最強(qiáng)，抑菌圈直徑均為11.6 mm，其次為蛋白胨+酵母粉，抑菌圈直徑為11.18 mm，胰蛋白胨和NH4Cl+牛肉膏作為氮源，抑菌能力差異不大，抑菌圈直徑分別為1 0.8 mm和10.68 mm。作為氮源抑制金黃色葡萄球菌能力最低的是牛肉膏，抑菌圈直徑為10.3 mm。大豆蛋白胨作為氮源時(shí)，JN-16對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制能力均相對(duì)較強(qiáng)，可作為最佳氮源。

圖7 改變氮源對(duì)菌株JN-16抑菌作用的影響

3 討論

芽孢桿菌類是目前研究比較廣泛的一類疫病防治微生物。已報(bào)道用于畜禽養(yǎng)殖中的芽孢桿菌種類主要有蠟樣芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、東洋芽孢桿菌等，它們具有拮抗病原菌活性，能夠增強(qiáng)機(jī)體免疫力，提高養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益（Defoirdt等，2011）。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌JN-16對(duì)恥垢分枝桿菌、金新分枝桿菌有抑制作用，但對(duì)其他分枝桿菌抑制作用較弱或無(wú)抑制作用，這可能是由于不同分枝桿菌產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)及作用機(jī)理不同所致（Gil，2011）。對(duì)枯草芽孢桿菌JN-16進(jìn)行了安全性試驗(yàn)及對(duì)胃腸道環(huán)境耐受性試驗(yàn)，結(jié)果顯示，枯草芽孢桿菌JN-16能夠耐受胃、腸液的消化，且該菌安全無(wú)毒，具備作為優(yōu)良益生菌株的條件（Cheesman 等，2012；何若天，2011）。

枯草芽孢桿菌JN-16發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果顯示，以葡萄糖為碳源、大豆蛋白胨為氮源、pH為6.5時(shí)在33℃或37℃培養(yǎng)24 h抑菌作用最強(qiáng)。王超等（2012）報(bào)道的一些枯草芽孢桿菌優(yōu)化結(jié)果同樣是以葡萄糖為氮源、33℃或37℃培養(yǎng)24 h抑菌效果均較好，而氮源大多選用酵母浸粉，且pH值在7.0～7.5。研究發(fā)現(xiàn)一些芽孢桿菌在不同溫度、不同環(huán)境的培養(yǎng)條件下，抑菌作用發(fā)生了變化，可能是由于芽孢桿菌在不同溫度和培養(yǎng)條件下產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)的不同，所以本株菌所產(chǎn)抑菌物質(zhì)尚待研究。

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