模擬鴨腸液中消化酶的批次來源與活性貢獻對飼料原料消化能力的影響

嚴 峰 趙 峰 米寶民 張 莉 齊智利 張宏福

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193;2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，武漢 4 30070)

在家禽體外模擬消化方法的研究中，模擬小腸液的制備一直是該領(lǐng)域的核心技術(shù)之一［1］。如何在定量確保模擬小腸液消化能力的前提下，兼顧消化酶的來源與被模擬動物體內(nèi)的消化酶具有種屬的同源性，是進一步提高模擬小腸液仿真程度的關(guān)鍵。長期以來，人們在禽用模擬小腸液的制備上，多以一定濃度的豬源性胰液素或試劑級胰蛋白酶、糜蛋白酶、淀粉酶等來制備模擬小腸液［2－5］，這種制備方法從消化酶的活性水平與同源性上都與動物體內(nèi)腸液相差甚遠。近年來，謝木林等［6］研究發(fā)現(xiàn)，鴨空腸液中淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶和脂肪酶這4種主要酶的消化能力占腸液所有酶消化總能力的86.39%以上，對收集的鴨空腸液初提純成粉劑后，通過試劑酶調(diào)節(jié)這4種主要消化酶的活性，制備的模擬鴨腸液的消化能力為體內(nèi)腸液消化能力的100.1%～103.5%。由此表明，以鴨腸液酶粉劑為基礎(chǔ)，加入部分試劑酶調(diào)節(jié)4種主要消化酶的活性后，可以獲得滿意的模擬鴨腸液制備效果，并在消化酶來源的同源性上有較大改善。然而，不同批次的鴨腸液酶粉劑與試劑酶組合后制備的模擬鴨腸液的消化能力是否有差異?鴨腸液酶粉劑與試劑酶對主要消化酶活性的貢獻在什么范圍內(nèi)不會影響模擬鴨腸液的消化能力?這2個問題的探討對模擬鴨腸液消化能力的穩(wěn)定性至關(guān)重要。為此，本研究以3個批次的鴨腸液酶粉劑為基礎(chǔ)，通過比較每批次酶粉劑內(nèi)，酶粉劑提供的主要消化酶活性與試劑酶提供的主要消化酶(淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶，以胰蛋白酶為參照計算比例)活性不同配比時，制備的模擬鴨腸液對玉米、豆粕、小麥麩的干物質(zhì)消化率與酶水解物能值的影響，探討模擬鴨腸液的制備中鴨腸液酶粉劑與試劑酶的適宜配比。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及飼料原料

選用健康、體重［(3.25±0.50)kg］基本一致的18周齡成年北京公鴨60只，隨機分成3組，每組20只。根據(jù)本實驗室禽用T型套管安裝方法，在鴨空腸中部安裝套管并進行相應(yīng)的術(shù)后護理［7］，試驗期間試驗鴨均飼喂基礎(chǔ)飼糧。為了考察模擬鴨腸液消化能力的差異，選擇3種常用飼料原料即玉米、豆粕和小麥麩。采用四分法取樣后用萬能粉碎機粉碎并過60目篩，充分混合均勻，貯存于樣品瓶中－20℃保存?zhèn)溆?。飼料原料和基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 飼料原料和基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平Table 1 Composition and nutrient levels of feed ingredients and the basal diet %

1)預(yù)混料為每千克飼糧提供The premix provided the following per kg of diet:VA 2 500 IU，VD 400 IU，VE 10 IU，VK30.5 mg，VB11.8 mg，VB24.0 mg，VB63.0 mg，VB120.007 mg，泛酸 pantothenic acid 11.0 mg，煙酸 nicotinic acid 55.0 mg，葉酸 folic acid 0.5 mg，生物素 biotin 0.12 mg，氯化膽堿 choline chloride 750 mg，Cu(as copper sulfate)8.0 mg，F(xiàn)e(as ferrous sulfate)80.0 mg，Zn(as zinc sulfate)40.0 mg，Mn(as manganese sulfate)60.0 mg，Se(as sodium selenite)0.15 mg，I(as potassium iodide)0.35 mg。

2)營養(yǎng)水平為實測值。Nutrient levels were measured values.

1.2 鴨腸液酶粉劑的制備

試驗鴨在安裝套管術(shù)后恢復(fù)30 d后，采用隔日重復(fù)采樣的方法于 09:30—10:30、13:30—14:30、17:30—18:30通過收集瓶在低溫條件下(0～4℃)收集鴨空腸食糜，搖勻后全部轉(zhuǎn)移至250 mL離心瓶中，于4℃、3 000 r/min條件下離心10 min，取上清液裝于1 000 mL樣品瓶中，－20℃保存?zhèn)溆?。?個試驗組分別收集到3 000 mL腸液后，4℃下解凍，過200目尼龍濾布，然后經(jīng)全自動蛋白質(zhì)透析純化系統(tǒng)(型號PFS－1，自主研制)透析3 h去雜質(zhì)后，再通過冷凍干燥機(LG J－4，北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司)及乙醇脫脂凍干后得到鴨腸液酶粉劑。鴨腸液酶粉劑中主要消化酶及試劑酶的活性見表2。

表2 鴨腸液酶粉劑中主要消化酶及試劑酶的活性Table 2 Activities of main digestive enzymes in intestinal fluid dry powder of ducks and enzyme reagents U/g

1.3 試驗設(shè)計

采用嵌套設(shè)計，其中獨立變量為鴨腸液酶粉劑的批次來源，設(shè)3個處理水平，分別為鴨腸液酶粉劑批次1、2、3;嵌套變量為模擬鴨腸液中鴨腸液酶粉劑提供的消化酶活性比例(以胰蛋白酶為基礎(chǔ))，設(shè) 4個處理水平，即 0(共用)、25%、50%、75%(表3)。為了保證所有模擬鴨腸液中淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性水平與鴨體內(nèi)腸液相應(yīng)消化酶的活性水平一致［4］，各處理中，通過加入相應(yīng)數(shù)量的試劑級消化酶以調(diào)節(jié)模擬鴨腸液中主要消化酶的活性。利用單胃動物仿生消化系統(tǒng)(SDS－2)，采用胃－小腸2階段消化，每種飼料原料設(shè)5個重復(fù)，每個重復(fù)1根消化管?？疾?0個模擬鴨腸液制備處理對玉米、豆粕、小麥麩干物質(zhì)消化率與酶水解物能值的影響。

1.4 測定方法

干物質(zhì)、總能的測定分別參照GB/T 6435—2006、ISO 9831—1998的方法進行測定。仿生消化方法參照《單胃動物仿生消化系統(tǒng)操作手冊》［8］。

1.5 數(shù)據(jù)計算與統(tǒng)計分析

干物質(zhì)表觀消化率(ADMD，%)=

［(M1－M2)/M1］×100;

酶水解物表觀能值(AEHGE，MJ/kg)=［(E1－ E2)/M1］/1 000;干物質(zhì)真消化率(TDMD，%)=［(M1－

M2+M0)/M1］×100;

酶水解物真能值(TEHGE，MJ/kg)=

［(E1－ E2+E0)/M1］/1 000。

式中:M1為飼料原料樣品干物質(zhì)重量(g);M2為殘渣干物質(zhì)重量(g);M0為消化酶干物質(zhì)殘留量(g);E1為飼料原料樣品總?cè)紵裏嶂?J);E2為殘渣總?cè)紵裏嶂?J);E0為消化酶干物質(zhì)殘留量總能值(J)。

根據(jù)嵌套設(shè)計，采用SAS 9.0統(tǒng)計軟件中的MEANS模塊對 ADMD、AEHGE、TDMD、TEHGE的基本統(tǒng)計量進行計算，GLM模塊對數(shù)據(jù)進行方差分析，以Duncan氏法對獨立變量內(nèi)嵌套變量間模擬鴨腸液對飼料原料的干物質(zhì)消化率和酶水解物能值進行多重比較，結(jié)果以平均值±標準差表示。

2 結(jié)果

2.1 模擬鴨腸液中鴨腸液酶粉劑的批次來源及活性貢獻對飼料原料干物質(zhì)消化率的影響

由表4可知，在模擬鴨腸液的消化酶來源對仿生消化中消化酶干物質(zhì)殘留量的影響上，3個批次的鴨腸液酶粉劑的平均酶殘留量為0.086 9～0.092 6 g/樣，批次間無顯著性差異(P＞0.05)。在模擬鴨腸液中，同一鴨腸液酶粉劑批次內(nèi)均呈現(xiàn)出隨著鴨腸液酶粉劑提供的消化酶活性的比例從25%增加到75%時，仿生消化中消化酶干物質(zhì)殘留量依次顯著遞增，從0.067 7 g/樣增加到0.116 9 g/樣(P＜0.05)，且都顯著高于試劑酶制備的模擬鴨腸液的消化酶干物質(zhì)殘留量(P＜0.05)。這與本試驗中純化的鴨腸液酶粉劑中有活性的消化酶含量不高，雜質(zhì)含量較高的材料狀況相對應(yīng)(表2)。

在模擬鴨腸液的消化酶來源對飼料原料干物質(zhì)消化率的影響上，3個批次的鴨腸液酶粉劑制備的模擬鴨腸液對玉米的干物質(zhì)表觀消化率(79.92%～80.10%)與真消化率(85.00% ～85.07%)均無顯著影響(P＞0.05);對豆粕的干物質(zhì)表觀消化率(61.68% ～62.41%)無顯著影響(P＞0.05)，但對其真消化率(71.75% ～72.24%)有顯著影響(P＜0.05);對小麥麩的干物質(zhì)表觀消化率(44.41% ～44.66%)和真消化率(49.29% ～49.64%)均無顯著影響(P＞0.05)。由于本試驗3個批次的鴨腸液酶粉劑制備的模擬鴨腸液對玉米、豆粕、小麥麩的干物質(zhì)表觀消化率與真消化率的最大相對差值都在0.75%以內(nèi)，處于SDS－2的測試精度范圍內(nèi)［12］，因此，認為3個批次鴨腸液酶粉劑制備的模擬鴨腸液在消化能力上是接近的。

表3 試驗設(shè)計與模擬鴨腸液處理水平Table 3 Experimental design and treatment levels of simulated intestinal fluid for ducks

模擬鴨腸液中消化酶的活性按照220 mL體積計算。The digestive enzyme activities of simulated intestinal fluid for ducks were measured in 220 mL.

在模擬鴨腸液中，同一鴨腸液酶粉劑批次內(nèi)均呈現(xiàn)出隨著鴨腸液酶粉劑提供的消化酶活性的比例從25%增加到75%時，模擬鴨腸液對玉米、豆粕、小麥麩的干物質(zhì)表觀消化率依次顯著下降(P＜0.05)，但干物質(zhì)真消化率相對穩(wěn)定(最大絕對差值0.95%，相對差值0.95%)，且干物質(zhì)真消化率均顯著地高于由試劑酶制備的模擬鴨腸液對這3種飼料原料的干物質(zhì)真消化率(P＜0.05)。這表明，模擬鴨腸液中鴨腸液酶粉劑提供的消化酶活性的比例從25%增加到75%時，其對飼料干物質(zhì)的消化能力是比較穩(wěn)定的，以鴨腸液酶粉劑為基礎(chǔ)制備的模擬鴨腸液比由3種主要消化酶試劑制備的模擬鴨腸液對飼料干物質(zhì)的消化能力高。

2.2 模擬鴨腸液中鴨腸液酶粉劑的批次來源及活性貢獻對飼料原料酶水解物能值的影響

由表5可知，在模擬鴨腸液的消化酶來源對仿生消化中消化酶干物質(zhì)殘留量總能值的影響上，3個批次的鴨腸液酶粉劑的消化酶干物質(zhì)殘留量總能值為877.10～940.50 J/樣，批次間無顯著性差異(P＞0.05)。在模擬鴨腸液中，同一鴨腸液酶粉劑批次內(nèi)均呈現(xiàn)出隨著鴨腸液酶粉劑提供的消化酶活性的比例從25%增加到75%時，仿生消化中消化酶干物質(zhì)殘留量總能值依次顯著遞增，從613.25 J/樣增加到1 120.13 J/樣(P＜0.05)，且都顯著高于試劑酶制備的模擬鴨腸液的消化酶干物質(zhì)殘留量總能值(P＜0.05)，這與鴨腸液酶粉劑添加量的變化趨勢是相對應(yīng)的。

在模擬鴨腸液的消化酶來源對飼料原料酶水解物能值的影響上，3個批次的鴨腸液酶粉劑制備的模擬鴨腸液對玉米的酶水解物表觀能值(16.21～16.33 MJ/kg)與真能值(16.74～16.85 MJ/kg)、豆粕的酶水解物表觀能值(14.25～14.32 MJ/kg)與真能值(15.26～15.35 MJ/kg)、小麥麩的酶水解物表觀能值(9.03～9.17MJ/kg)與真能值(9.53～9.65 MJ/kg)均無顯著影響(P＞0.05)，且其差值均在SDS－2的測試精度范圍內(nèi)［12］，這進一步證明了不同批次來源的鴨腸液酶粉劑制備的模擬鴨腸液的消化能力是接近的。

在同一鴨腸液酶粉劑批次制備的模擬鴨腸液內(nèi)，隨著鴨腸液酶粉劑提供的消化酶活性的比例從25%增加到75%時，模擬鴨腸液對玉米、豆粕、小麥麩的酶水解物表觀能值均呈顯著性遞減(P＜0.05)，對酶水解物真能值間也有顯著性影響(P＜0.05)，但鴨腸液酶粉劑提供的消化酶活性的比例從25%增加到50%范圍內(nèi)，模擬鴨腸液對玉米、豆粕、小麥麩的酶水解物真能值相對穩(wěn)定(最大絕對差值0.17 MJ/kg，相對差值0.89%)，與鴨腸液酶粉劑貢獻75%的消化酶活性時配制的模擬鴨腸液的對應(yīng)值有較大差異，且均顯著高于由試劑酶制備的模擬鴨腸液對這3種飼料原料的酶水解物真能值(P＜0.05)。這表明，模擬鴨腸液中鴨腸液酶粉劑提供的消化酶活性的比例從25%增加到50%時，其對飼料有機物的消化能力是比較穩(wěn)定的。

3 討論

3.1 模擬鴨腸液中鴨腸液酶粉劑的批次來源對飼料原料消化能力的影響

在體外模擬消化中，主要消化酶的動物種屬來源可能會影響消化液所表現(xiàn)的綜合酶學(xué)特性。據(jù)Irene等［9］報道，從生長豬與肉雞體內(nèi)獲得的胃蛋白酶在酶學(xué)特性(針對不同底物的最適pH、消化能力)上存在著較大的差異。然而，長期以來，人們在家禽體外模擬消化方法的研究上，都采用豬小腸液［10－11］或豬胰液素［12］等豬源性消化酶來模擬家禽的小腸液。這種方法制備的家禽模擬小腸液可能與體內(nèi)小腸液的酶學(xué)特性有一定偏差。為此，本實驗室前期在建立了家禽腸道食糜的連續(xù)采集方法［7］、冷凍濃縮－透析－冷凍干燥制備鴨腸液酶粉劑的粗提純方法［1］的基礎(chǔ)上，研究了以鴨腸液酶粉劑為基礎(chǔ)，通過加入少量試劑酶(淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、脂肪酶)制備的模擬鴨腸液的消化能力為對應(yīng)消化酶活性的鴨體內(nèi)空腸液消化能力的100.1%～101.8%(4種飼料原料，4種飼糧)［6］。由此表明，以鴨腸液酶粉劑為基礎(chǔ)，通過調(diào)節(jié)幾種主要消化酶的活性與體內(nèi)腸液的消化酶活性相一致，可能是解決模擬鴨腸液同源性問題的有效手段。然而，以不同批次來源的鴨腸液酶粉劑為基礎(chǔ)，通過調(diào)節(jié)幾種主要消化酶的活性到同一水平制備的模擬鴨腸液是否具有相同的消化能力是檢驗通過該方法能否制備穩(wěn)定模擬鴨腸液的關(guān)鍵問題之一。本試驗中，以3個批次的鴨腸液酶粉劑為基礎(chǔ)制備的模擬鴨腸液對玉米、豆粕和小麥麩3種飼料原料的干物質(zhì)真消化率和酶水解物真能值的最大差異不超過0.60%，這一差異處于 SDS－2測試的系統(tǒng)誤差范圍之內(nèi)［13］。由此可見，以不同批次來源的鴨腸液酶粉劑為主要酶源制備的模擬鴨腸液的消化能力是穩(wěn)定的。

?

?

3.2 模擬鴨腸液中鴨腸液酶粉劑的活性貢獻對飼料原料消化能力的影響

在模擬鴨腸液制備的消化酶活性的定量水平上，Valdes等［12］以4 mg/mL胰液素為主要酶源制備模擬雞腸液，Clunies等［14］以豬小腸液(空腸食糜離心后的上清液)直接用于模擬雞空腸液。這些制備方法除了在消化酶的種屬同源性上與家禽體內(nèi)的消化酶不同外，在消化酶的活性水平上也與動物體內(nèi)腸液相差甚遠，它們無法解決模擬消化液消化能力的重現(xiàn)性問題。本實驗室前期研究了根據(jù)與鴨體內(nèi)腸液中4種主要消化酶的活性相等的原則，通過4種試劑酶(淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、脂肪酶)制備模擬鴨腸液［4］。這種方法制備的模擬鴨腸液與對應(yīng)體內(nèi)腸液的消化能力雖然還有一定差距［6］，但在模擬鴨腸液消化能力的重現(xiàn)性上，具有較好的重復(fù)性［13］。為了進一步提高模擬鴨腸液的仿真程度，本實驗室研究了以鴨腸液酶粉劑為基礎(chǔ)，通過加入少量試劑酶(淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、脂肪酶)制備的模擬鴨腸液與體內(nèi)腸液的酶學(xué)特性非常接近［6］。在該方法中，鴨腸液酶粉劑與試劑酶各自貢獻的消化酶活性占模擬鴨腸液消化酶總活性的比例在哪個范圍內(nèi)不會影響模擬消化液的消化能力是今后模擬鴨腸液制備規(guī)范的一個重要參數(shù)。從本試驗的結(jié)果看，鴨腸液酶粉劑與試劑酶對模擬鴨腸液中消化酶總活性(以蛋白酶為基礎(chǔ))的貢獻在25%和75%，50%和50%時，2種模擬鴨腸液對同一飼料原料的干物質(zhì)真消化率和酶水解物真能值的差異均在0.88%、0.17 MJ/kg以內(nèi)，這一差異處于SDS－2測試的系統(tǒng)誤差范圍之內(nèi)［12］。而這2種模擬鴨腸液比75%和25%處理的模擬鴨腸液對飼料原料的干物質(zhì)真消化率和酶水解物真能值分別高0.45%、0.67 MJ/kg。根據(jù)3個模擬鴨腸液的消化酶干物質(zhì)殘留量及對飼料原料的表觀消化率的變化規(guī)律可以得出，75%和25%處理與其他2個處理的模擬鴨腸液對飼料原料的消化能力稍低可能與仿生消化中消化酶干物質(zhì)殘留的干擾有關(guān)。綜合上述結(jié)果，鴨腸液酶粉劑對模擬鴨腸液中消化酶總活性的貢獻在25%～50%就可以達到較好的模擬效果。與此同時也說明，鴨腸液酶粉劑還需要進一步純化，以降低雜質(zhì)對測試結(jié)果的干擾。

4 結(jié)論

①在模擬鴨腸液中，不同批次來源的鴨腸液酶粉劑對玉米、豆粕、小麥麩干物質(zhì)消化率與酶水解物能值無顯著性差異。

②在模擬鴨腸液內(nèi)，鴨腸液酶粉劑對模擬鴨腸液中消化酶總活性的貢獻在25%～50%時消化能力相對穩(wěn)定。

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