瘤胃保護性精氨酸及N－氨甲酰谷氨酸對細毛羊腸道黏膜蛋白質(zhì)合成率的影響

趙宏麗 孫海洲 李金霞 趙存發(fā) 桑 丹 李勝利 張春華

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院動物營養(yǎng)研究所，呼和浩特 010031;2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)院，呼和浩特 010018;3.海拉爾農(nóng)墾集團特泥河分公司，海拉爾 021024)

提高動物機體蛋白質(zhì)的利用率是動物營養(yǎng)學(xué)者的主要目標之一。蛋白質(zhì)利用率的提高不僅意味著可以降低飼養(yǎng)成本，而且可以減少碳氮排放起到保護環(huán)境的作用。與單胃動物相比，反芻動物氮的利用率只有20% ～30%，具有很大的提高潛力，因此提高反芻動物氮的利用率一直是動物營養(yǎng)研究者的重任之一。腸道作為氨基酸及蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)吸收的最終場所，起到調(diào)節(jié)氨基酸進入門脈循環(huán)及血液的形式的作用［1］，其結(jié)構(gòu)的完整性以及功能的正常發(fā)揮對氨基酸代謝起著關(guān)鍵的作用［2］。與外周組織相比，腸道蛋白質(zhì)合成占機體9% ～12%［3］。腸道不僅是機體重要的消化代謝吸收器官，也是很重要的免疫器官和防護屏障，參與機體的特異性免疫和非特異性免疫［4－5］，同時其緊密連接的連續(xù)的單層上皮細胞構(gòu)成一道隔離外界復(fù)雜環(huán)境的物理屏障［6］。

隨著對氨基酸功能研究的不斷深入，在嚙齒類動物和單胃動物上研究發(fā)現(xiàn)，功能性氨基酸精氨酸(Arg)和亮氨酸作為腸上皮細胞哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路的有效調(diào)節(jié)因子，可以促使腸道蛋白質(zhì)合成，抑制蛋白質(zhì)降解，從而促進腸黏膜上皮細胞增殖生長［7］。特別是Arg不僅參與蛋白質(zhì)的合成，而且也是一氧化氮(NO)、尿素、多胺、鳥氨酸、脯氨酸、肌酸、谷氨酸鹽和胍丁胺等重要生理活性物合成的主要前體物。其中NO在調(diào)節(jié)腸道的血流量及內(nèi)分泌，維持腸道完整性和腸細胞遷移方面均發(fā)揮著重要的作用［8］。目前關(guān)于Arg對腸道生理功能方面的研究主要集中在單胃動物豬、雞和嚙齒類動物鼠上，已有報道指出Arg具有調(diào)節(jié)腸道及機體免疫力的功能［9－10］，因此對腸道損傷也具有一定的治療作用［11］。關(guān)于Arg的中間代謝產(chǎn)物N－乙酰谷氨酸(NAG)的類似物N－氨甲酰谷氨酸(NCG)，目前在單胃動物仔豬上有報道表明，基礎(chǔ)飼糧中添加0.08%的NCG可以提高日增重以及空腸、十二指腸、回腸的絨毛高度和隱窩深度，進而提高了腸道重量，同時提高了空腸和十二指腸的杯狀細胞數(shù)量［12］。關(guān)于Arg及NCG在幼齡反芻動物上面的作用，李金霞［13］在2010年通過飼養(yǎng)試驗在飼糧中添加瘤胃保護性Arg及NCG進行了相關(guān)的研究。本試驗采用一次性大劑量灌注L－苯丙氨酸來研究瘤胃保護性Arg及NCG對羔羊腸道黏膜蛋白質(zhì)合成率的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

選用15只體況良好，平均體重為(25.00±3.39)kg的5月齡半同胞羯鄂爾多斯細毛羊，按體重隨機分為5組，每組3只。

1.2 試驗飼糧

試驗基礎(chǔ)飼糧配制參照NRC(2007)綿羊飼養(yǎng)標準，基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平參見表1。對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧(1組)，試驗組飼喂在基礎(chǔ)飼糧中分別添加0.15 g/d NCG(2組)、0.20 g/d NCG(3組)、1.50 g/d Arg(4組)和 2.00 g/d Arg(5組)的試驗飼糧。Arg及NCG分別購自北京優(yōu)尼康生物科技有限公司和北京菲迪飼料科技有限責(zé)任公司。關(guān)于瘤胃保護性Arg和NCG的制備及穩(wěn)定性檢測參見李金霞［13］的方法。

1.3 飼養(yǎng)管理

試羊空腹稱重后，安裝集糞袋、集尿袋，放入代謝籠飼養(yǎng)，每日在06:00和18:00分別先粗后精等量飼喂2次，自由飲水。每日準確記錄試驗羊的采食量和剩草料量，預(yù)試期為15 d，正試期為45 d。

1.4 試驗方法

每組分別選取1只羔羊，采用大劑量一次灌注法，測定腸道黏膜的蛋白質(zhì)合成率。1.4.1 灌注液的制備

灌注劑量:按每千克代謝體重(kg W0.75)灌注0.2 g L－苯丙氨酸(其中含99%L－苯丙氨酸－D5，Cambridge Isotope Laboratory，美國)。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels ofthe basal diet(DM basis)

1)每千克預(yù)混料含有One kilogram of premix contained the following:VA 600 000IU，VD3120 000IU，VE 2 400 mg，F(xiàn)e 9 000 mg，Cu 1 500 mg，Zn 9 000 mg，Mn 4 000 mg，I 90 mg。

2)干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)、鈣、磷、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維為測定值，其他營養(yǎng)水平均為計算值。DM，CP，Ca，P，NDF and ADF were measured values，while the other nutrient levels were calculated values.

將所有羊只用的L－苯丙氨酸一次稱好，按每只羊150 mL生理鹽水溶解。用0.2 μm的濾膜過濾溶液，用真空泵或水泵可加速過濾。溶液高壓滅菌15 min。高壓滅菌后的溶液可置于室溫過夜。在灌注的當(dāng)天，將灌注液稍稍加熱至約40℃，然后將灌注液吸入50 mL無菌注射器中，并放在40℃的培養(yǎng)箱內(nèi)準備灌注。平均每只羊灌注150 mL灌注液。

1.4.2 頸靜脈血插管的安裝

于灌注L－苯丙氨酸前30 min在2側(cè)頸靜脈插入靜脈滯留針，接上三通，其中一側(cè)三通的另一側(cè)接上靜脈延長管，用于L－苯丙氨酸的灌注;另一個直接用于血液樣本的采集。

1.4.3 灌注和采樣

原因：鈣劑作為骨骼重建所需要的一種原材料，當(dāng)將其補充入體內(nèi)后，首先需要人體能夠?qū)⑵湮绽?，而維生素D 或活性維生素D恰恰可以起到促進鈣吸收的作用。

將試驗羊于第16天08:00開始灌注L－苯丙氨酸，進行蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)的測定。

灌注前在預(yù)先刮好的皮膚上用普魯卡因進行局部麻醉，用直徑1 cm的環(huán)鉆在該區(qū)域的后底緣采取2個皮膚組織樣品，用作組織的本底樣品(t0)。采下的樣品用冰生理鹽水沖洗，液氮冷凍，－80℃冷藏保存。

通過一側(cè)頸靜脈插管將L－苯丙氨酸灌注液緩慢注入，10 min內(nèi)注完。注完后，用生理鹽水沖洗插管。不能用該插管采集任何血液樣品。

灌注前，從另一側(cè)頸靜脈插管采取血液樣品作為0時間點樣品。灌注開始后，分別在5(灌注中)、10(灌注后)、20、40、60、90 min 采取血樣，每次采血5～10 mL。置于冰中保存，然后在4℃條件下2 000×g離心15 min，血漿樣品 －20℃保存，供同位素苯丙氨酸分析。采完血樣后，要用肝素－生理鹽水沖血插管。

灌注90 min后，再用戊巴比妥鈉麻醉，之后屠宰，防止腸道細胞死亡形成腐肉。

迅速放血屠宰。切開腹腔取出全部小腸，迅速置入含有雙抗的冰凍磷酸鹽緩沖液(PBS)中。剪開腸系膜，將腸段打開，將各腸斷剪成5 cm的小段，將部分空腸和十二指腸剖開腸管，冰凍PBS沖洗干凈后，用定性濾紙將黏膜表面的PBS吸干，用載玻片將腸黏膜輕輕地刮下來，分裝后液氮保存，待測。準確記錄組織樣品的采樣時間。

1.5 分析方法

1.5.1 血漿樣品及組織樣品的前處理

方法參考 Garlick 等［14］。

方法參考 Liu 等［15］。

1.6 計算方法

血漿游離氨基酸中示蹤苯丙氨酸豐度(MPEp)等于采樣期內(nèi)各時間點血漿示蹤苯丙氨酸豐度的加權(quán)平均值，公式如下:

MPEp=5×(MPE0+MPE5)/2+5×

(MPE5+MPE10)/2+10×(MPE10+

MPE20)/2+20×(MPE20+MPE40)/2+20×

(MPE40+MPE60)/2+30×(MPE60+

MPE90)/2－MPE0。

式中:MPE0、…、MPE90 分別為 0、…、90 min的血漿游離氨基酸中示蹤苯丙氨酸豐度。

組織蛋白質(zhì)合成率根據(jù)Lobley等［16］的公式計算。

蛋白質(zhì)合成

式中:MPEt0和 MPEt分別為0(本底值)和90 min組織中蛋白質(zhì)結(jié)合的示蹤苯丙氨酸豐度。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SAS 9.0軟件包中的ANOVA過程進行方差分析和F檢驗。

2 結(jié)果

由表2所示的各組蛋白質(zhì)合成率來看，各試驗組的空腸黏膜和十二指腸黏膜的蛋白質(zhì)合成率與對照組比較差異均顯著(P＜0.05)。

對于空腸黏膜，各組的蛋白質(zhì)合成率依次為:4組＞3組＞5組＞2組＞1組，與1組相比，4組、3組、5組和2組的空腸黏膜蛋白質(zhì)合成率分別顯著提高了 38.41%、31.37%、29.27%、17.48%(P＜0.05)，其中4組與其他各試驗組差異顯著(P＜0.05)，但3組與5組差異不顯著(P＞0.05)。

十二指腸黏膜蛋白質(zhì)合成率依次為:4組＞5組 ＞3組 ＞2組 ＞1組，與1組相比，4組、5組、3組和2組的十二指腸黏膜的蛋白質(zhì)合成率分別顯著提高了 35.18%、12.39%、9.51%、和 6.62%(P＜0.05)，4組與其他各試驗組差異顯著(P＜0.05)，3組與5組差異不顯著(P＞0.05)，與空腸黏膜結(jié)果相一致，但2組與3組差異不顯著(P＞0.05)。

綜合空腸黏膜和十二指腸黏膜的試驗結(jié)果得出，3組、4組與5組對腸道黏膜蛋白質(zhì)合成率提高幅度較大，其中以4組提高幅度最大，效果最好。

表2 瘤胃保護性Arg及NCG對細毛羊小腸黏膜蛋白質(zhì)合成速率的影響Table 2 Effects of rumen protected arginine and N－carbamylglutamic acid on synthesis rate of protein in small intestinal mucosa of fine－wool sheep %/d

同行數(shù)據(jù)肩標不同小寫字母表示差異顯著(P＜0.05)，相同小寫字母表示差異不顯著(P＞0.05)。

In the same row，values with different small letter superscripts mean significant difference(P ＜0.05)，while with the same small letter superscripts mean no significant difference(P＞0.05).

3 討論

小腸作為營養(yǎng)物質(zhì)吸收的首要器官，對飼糧蛋白質(zhì)和氨基酸的消化、吸收、代謝均起著重要的作用。有研究表明小腸是人和動物氨基酸代謝的主要場所，飼糧中30% ～50%的必需氨基酸首先被腸道所代謝［2］，其每天的蛋白質(zhì)合成率是周緣組織的數(shù)倍［17－18］。因此研究腸道對氨基酸不同代謝途徑對于掌握機體氨基酸的利用率和蛋白質(zhì)的需要量有著重要的意義。

表3涵蓋了1987年至2007年應(yīng)用穩(wěn)定性同位素試驗法得出的豬、雞、牛和羊的腸道蛋白質(zhì)合成率。這些究結(jié)果均表明，與外周組織相比，腸道的蛋白質(zhì)合成率較高。本試驗在5月齡羯鄂爾多斯細毛羊羔羊的基礎(chǔ)飼糧中添加瘤胃保護性Arg及NCG得到的腸黏膜蛋白質(zhì)合成率處于50%～90%。

表3 畜禽腸道蛋白質(zhì)合成率Table 3 Intestinal protein synthesis rate in livestock and poultry

腸道作為聯(lián)系機體第1基因組(機體本身的基因組)與第2基因組(微生物基因組)的紐帶，對于成年動物是Arg內(nèi)源合成很關(guān)鍵的場所之一。存在于腸道的NAG合成酶和二氫化吡咯－5羧化酶(P5C)可以合成Arg的前體物瓜氨酸，瓜氨酸進入腎臟以后在精氨基琥珀酸合酶和裂解酶的催化下進一步合成機體所需的Arg［28－29］。但對于幼齡動物，Wu等［30］于2004年在仔豬上的報道指出，仔豬出生1～7日齡時，腸道的Arg琥珀酸合酶和裂解酶活性很高，瓜氨酸可以局部合成Arg來滿足其生長需要，但14～21日齡時，腸道內(nèi)2個關(guān)鍵性的酶活降低，Arg的內(nèi)源合成受限必須通過飼糧供給得以滿足。此外甄玉國等［31］在反芻動物絨山羊上發(fā)現(xiàn)小腸可吸收氨基酸的供應(yīng)對組織蛋白質(zhì)有著顯著的影響作用，而反芻動物對蛋白質(zhì)和氨基酸的利用有限，因此在飼糧中添加一些具有調(diào)節(jié)腸道功能的氨基酸具有一定的生理意義。而功能性氨基酸Arg與谷氨酰胺一樣對腸道功能具有調(diào)節(jié)作用［32－33］。

本試驗在羔羊飼糧中添加瘤胃保護性Arg及NAG的類似物NCG來探究其對反芻動物腸道蛋白質(zhì)合成能力的作用，得到了較為理想的試驗結(jié)果，為開拓Arg在反芻動物方面的應(yīng)用提供參考。試驗中采用的一次性大劑量灌注同位素示蹤法克服了連續(xù)性灌注同位素法的游離氨基酸難以標記的缺陷以及傳統(tǒng)氮代謝試驗的不精確性。關(guān)于該法的優(yōu)勢和實用性Garlick等［14］在1980年進行了詳盡的報道。

4 結(jié)論

添加瘤胃保護性Arg及NCG對腸道黏膜蛋白質(zhì)合成率具有提高作用，分別以1.50 g/d Arg和0.20 g/d NCG 2個劑量較好。

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