3個不同地理日本沼蝦天然群體遺傳多樣性的SSR分析

2014-10-23 11:59夏建海范武江王曉清

湖南師范大學學報·自然科學版 2014年4期

夏建海+范武江+王曉清

摘要利用11對微衛(wèi)星引物對洞庭湖、鄱陽湖、龍感湖的日本沼蝦天然群體進行遺傳多樣性的分析，評價不同地理日本沼蝦天然群體的遺傳多樣性和遺傳分化水平.在3個日本沼蝦群體中共獲得90個等位基因，各位點平均等位基因為8.182個，各群體的平均等位基因數(shù)在（A）32～38之間，平均多態(tài)信息含量（PIC）介于0.590 7～0.643 0，平均期望雜合度He為0.657 7～0.705 5、平均觀測雜合度Ho為0.514 1～0.579 9.群體間各位點Shannon指數(shù)均大于1，F(xiàn)is均為正值，群體間平均近交系數(shù)為19%，F(xiàn)st值顯示整個群體分化程度較低，其中遺傳變異的538%存在于群體之間，94.62%存在于個體之間.結果表明：3個日本沼蝦天然群體的遺傳多樣性較高，分化程度較低，其中鄱陽湖群體遺傳多樣性最豐富，遺傳分化水平最低.

關鍵詞日本沼蝦；微衛(wèi)星；遺傳多樣性；遺傳分化

中圖分類號S917文獻標識碼A文章編號10002537（2014）04002306

日本沼蝦（Macrobrachium nipponense）俗稱青蝦、河蝦，隸屬甲殼綱（Crustacea）、十足目（Decapoda）、長臂〖HJ1.8mm〗蝦科（Palaemonidae）、沼蝦屬（Macrobrachium） [12] .湖南洞庭湖、江西鄱陽湖、湖北龍感湖是我國日本沼蝦天然資源較豐富的分布區(qū)和產區(qū)[34].近年來，日本沼蝦由于營養(yǎng)豐富、口味鮮美、市場價值較高而得到廣泛養(yǎng)殖[56].國內外有關日本沼蝦遺傳多樣性的研究，已報道的有采用線粒體16SrRNA序列片段變異和COI方法分析長江和五大淡水湖天然日本沼蝦群體遺傳多樣性[78]，采用RAPD[9]和AFLP[10]方法分析長江、龍港湖、太湖等天然日本沼蝦群體遺傳多樣性，使用線粒體COI序列分析我國九大水系、五大淡水湖及長江中下游流域日本沼蝦種質資源遺傳多樣性和系統(tǒng)進化[1112]，以及采用微衛(wèi)星標記研究太湖、洪澤湖、錢塘江天然日本沼蝦遺傳多樣性[1315].本研究采用SSR標記技術分析我國洞庭湖、鄱陽湖、龍感湖日本沼蝦群體的遺傳多樣性，探討三大湖泊日本沼蝦群體的遺傳結構和群體分化水平，以期為保護我國天然日本沼蝦種質資源及合理開發(fā)利用提供更科學的理論依據(jù).

1材料與方法

1.1樣本的采集及DNA提取

2011年12月分別對湖南洞庭湖（DT）、江西鄱陽湖（PY）、湖北龍感湖（LG）3個天然日本沼蝦群體進行采樣，具體采樣地點如表1所示.每個群體采樣29尾，剪取尾部肌肉用無水乙醇固定后帶回實驗室，放入4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?基因組DNA的提取參照目前通用的柱式肌肉試劑盒（天恩澤試劑公司）方法操作，并檢測其濃度和純度，-20 ℃保存?zhèn)溆?

1.2微衛(wèi)星引物的篩選及擴增

從相關文獻和GenBank庫中搜索青蝦微衛(wèi)星序列，設計了47對引物，委托上海生工生物工程技術服務公司合成.首先用2個樣本篩選引物，并摸索PCR條件.反應體系：PCR MagicMIX 7.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL， DNA模板0.5 μL，ddH2O 6.0 μL.PCR反應條件：94 ℃變性4 min，94 ℃ 30 s，退火30 s，72 ℃延伸1 min，經過26個循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存.各引物的退火溫度見表2.PCR產物經1%（質量分數(shù)，下同）的瓊脂糖電泳檢測合格后，用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，用pBR322DNA/Msp I作為相對分子質量標準，銀染后拍照分析.

1.3 數(shù)據(jù)處理

參照Marker大小對所擴增條帶估算相對分子質量，確定其基因型，并利用GENEPOP1.32軟件進行數(shù)據(jù)分析，分別計算等位基因數(shù)、等位基因頻率、有效等位基因數(shù)、觀測雜合度、期望雜合度、HardyWeinberg遺傳偏離指數(shù)、遺傳分化，用PICCALC軟件對各微衛(wèi)星位點的多態(tài)信息含量進行計算.

2結果與分析

2.1引物篩選與擴增圖譜

選取11對微衛(wèi)星引物進行PCR擴增，在3個群體中均獲得較好的擴增結果，圖1為引物Mn11擴增圖譜.11對引物共獲得90個等位基因，各位點出現(xiàn)等位基因3～13個不等，平均獲得8.182個等位基因，其中Mn 24位點獲得等位基因最多為13個，其次Mn 5和Mn 37位點為11個，Mn3位點獲得位點最少為3個.

2.2各群體遺傳多樣性分析

11個微衛(wèi)星位點在3個群體中的遺傳多樣性參數(shù)見表3，通過每個微衛(wèi)星位點的基因頻率計算出每個位點在群體中的平均多態(tài)信息含量（PIC）介于0.454 7～0.750 4，其中Mn27位點所含多態(tài)信息含量最高為0.750 4，Mn3位點多態(tài)信息含量最低為0.454 7，其余基因位點PIC值均在0.5以上，這表明各位點均為較高多態(tài)位點，方可有效進行后續(xù)分析.3個群體在11個微衛(wèi)星位點的遺傳多樣性參數(shù)見表4，其平均有效等位基因介于3.191 9～3.458 2，平均期望雜合度、觀測雜合度和平均多態(tài)信息含量鄱陽湖最高分別為0705 5、0.579 9、0.643 0.這表明3個群體中鄱陽湖的遺傳多樣性最高.

2.3微衛(wèi)星位點HardWeiberg平衡分析

經卡方檢驗各位點在群體中的HardWeiberg平衡檢驗P值（表5），發(fā)現(xiàn)鄱陽湖、龍感湖均有4個位點顯著偏離HardWeiberg平衡，其中洞庭湖最多，有5個位點顯著偏離HardWeiberg平衡，1個發(fā)生平衡偏離.

2.4群體遺傳變異分析

3討論

3.13個地理日本沼蝦天然群體的遺傳多樣性

本研究利用篩選出的11對微衛(wèi)星引物對洞庭湖、龍感湖和鄱陽湖3個日本沼蝦群體的遺傳多樣性分析表明，其多態(tài)信息含量PIC介于0.454 7～0.750 4之間.根據(jù)高度多態(tài)性信息含量衡量標準，PIC>0.5[16]，除Mn3位點處于中度多態(tài)位點，其余均屬于高度多態(tài)性位點.從龍感湖、洞庭湖、鄱陽湖實驗數(shù)據(jù)依次來看，平均等位基因數(shù)為32、35、38，平均多態(tài)信息含量（PIC）0.5907、0.6115、0.6430，平均期望雜合度（He）0.657 7、0.679 8、0.705 5，比洪澤湖日本沼蝦（He=0.698～0.804）[14]、錢塘江日本沼蝦（He=0.83～0.88）[15]和太湖日本沼蝦（He=0.893 7～0.934 4）[13]的平均期望雜合度低，與楊頻[17]等對鄱陽湖日本沼蝦群體遺傳多樣性分析的結果有較大差異，其主要原因是湖泊面積較大，采樣范圍和數(shù)量較少導致.研究表明洞庭湖、龍感湖和鄱陽湖3個日本沼蝦群體的遺傳多樣性較高，其中鄱陽湖遺傳多樣性最為豐富，龍感湖遺傳多樣性最低，與蔣速飛等[9]、馮建彬等[18]對我國各大湖泊日本沼蝦群體遺傳多樣性的結論相似.根據(jù)Shannon多樣性指數(shù)，鄱陽湖、洞庭湖，龍感湖的遺傳變異程度依次為1.316 8，1.262 3，1210 1，進一步說明鄱陽湖群體的遺傳多樣性最為豐富，這可能與鄱陽湖域的水文環(huán)境變化大有密切的關系.

3.2日本沼蝦群體內的HardyWeinberg平衡狀況

利用HardyWeinberg平衡定律對每個位點平衡狀態(tài)的分析結果（表4）表明，每個群體中均有4個位點顯著偏離HardyWeinberg平衡，顯現(xiàn)雜合不足，說明這3個群體多數(shù)微衛(wèi)星位點偏離HardyWeinberg平衡，據(jù)HardyWeinberg平衡基本條件，足夠大的群體交配隨機，未出現(xiàn)選擇、遷移、突變和遺傳漂變等現(xiàn)象[19]，偏離平衡的原因主要在于日本沼蝦自身的特點和生活習慣，并受其水域環(huán)境的影響，也反映了由于內陸湖泊長期與江湖阻隔以及生境條件的不同，導致群體內遺傳分化較嚴重.另一個原因是長年受人們捕撈過度的影響導致群體內自交現(xiàn)象比較嚴重 [13]，從而使得這3個群體日本沼蝦偏離HardyWeinberg平衡.因此，除了自然因素的制約，人為因素也會加快日本沼蝦天然遺傳資源的稀釋和衰退速度，進一步導致種質退化和優(yōu)良性狀的喪失.

3.33個日本沼蝦群體間遺傳分化分析

Fst值和基因流是衡量群體間的遺傳分化程度的主要指標，本實驗得出各位點的F統(tǒng)計量參數(shù)顯示，F(xiàn)is均為正值，群體間平均近交系數(shù)為19%，F(xiàn)st值介于0.017 6～0151 5，屬于中等偏低分化（0.05

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