2個鯉魚群體遺傳多樣性的RAPD分析

杜民　牛寶珍　劉艷紅　等

摘要：從50條隨機引物中篩選出10條有效引物，采用RAPD技術對蒙自響水河和草壩的2個鯉魚群體進行遺傳多樣性分析。結果表明：在2個群體中分別檢測到47、53個位點，多態(tài)位點分別為44、51個，平均多態(tài)位點比例分別為93.61%和96.23%；利用Popgene version1.32軟件分析獲得2個鯉魚群體Shannon信息指數(shù)（I）分別為0.479 9和0.455 7，Neis基因多樣性指數(shù)（H）分別為0.328 7和0.298 4，等位基因觀察數(shù)（Na）分別為1.821 4和1.910 7，有效等位基因數(shù)（Ne）分別為1.584 3和1.487 9，群體間的遺傳相似性系數(shù)為0.958 1，遺傳距離為0.041 9。2個鯉魚群體間的遺傳分化系數(shù)Gst為0.082 4，表明群體間的遺傳變異占總的遺傳變異的8.24%，群體內的遺傳變異占總變異的91.76%。

關鍵詞：鯉魚；RAPD；遺傳多樣性

中圖分類號： S917.4文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）01-0047-03

收稿日期：2014-03-12

基金項目：國家自然科學基金（編號：31360638）；云南省教育廳科學研究基金重大專項（編號：ZD2013009）；紅河學院中青年學術帶頭人后備人才項目（編號：2014HB0203）；紅河學院博士專項（編號：14BS11）。

作者簡介：杜民（1974—），男，湖北棗陽人，博士，副教授，主要從事水生生物技術與資源研究。Tel：（0873）3799787；E-mail：du2005min@126.com。

通信作者：劉艷紅，博士，教授，主要從事水域資源與環(huán)境管理政策研究。Tel：（0873）3698575；E-mail：kidliu1968@126.com。自從隨機擴增多態(tài)性DNA技術（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）于1990年由美國科學家Williams等和Welsh等分別建立起來[1-2]以后，已在遺傳多樣性的檢測、物種分類和演化、品種鑒定、種群的親緣關系、構建魚類遺傳連鎖圖譜、魚類育種和雜種優(yōu)勢等研究方面得到應用并且效果良好。陳國生應用RAPD技術分析了閩江中上游黑脊倒刺鲃和黃顙魚遺傳多樣性[3]。趙凱利用RAPD技術對4種鯉科魚類的基因組DNA進行了分析，結果表明鯉亞科2種魚種間相似性明顯高于青海湖裸鯉和草魚種間的相似性，然而另外2個鯉亞科3種魚與裂腹魚亞科的青海湖裸鯉之間的差異顯著高于鯉亞科鯉與雅羅魚亞科草魚、鯽魚之間的差異[4]。

鯉魚（Cyprinus carpio）屬硬骨魚綱（Osteichthyesu）輻鰭亞綱（Actinopterygii）鯉形總目（Cyprinomopha）鯉科（Cyprinidae），是一種最常見的淡水魚，在各個淡水水域均有分布，也是我國淡水養(yǎng)殖的主要經濟魚之一。天然水域的污染和過度捕撈利用等原因造成鯉魚棲息環(huán)境嚴重破壞，因此了解并保護鯉魚種質資源顯得極為迫切。本研究利用RAPD方法對云南省蒙自市響水河和草壩水體的2個鯉魚群體進行分子遺傳分析，探討其遺傳多樣性，為鯉魚資源的科學管理和合理開發(fā)提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

供試魚來自于云南省蒙自市草壩水體和響水河水庫，每個水體各采集6尾。取活魚的尾鰭分別裝入1.5 mL離心管中，加入無水乙醇并于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2方法

1.2.1試劑、儀器及基因組DNA提取Taq酶、dNTP、Marker 及10×Buffer（博邁德生物科技公司）；Tris酚（北京鼎國昌盛生物技術有限公司）；PCR儀：EDC-810（東勝創(chuàng)新生物科技有限公司）；紫外透射儀：DYY-11（北京六一儀器廠）；高速離心機：HC-2062（安徽中科中佳科學儀器有限公司）。參照杜民等的方法[5]提取鯉魚基因組總DNA并放于 -4 ℃ 冰箱。取5 μL DNA樣品和適量溴酚藍充分混勻后，利用1%濃度的瓊脂糖凝膠電泳后在凝膠成像系統(tǒng)進行檢測，觀察到鯉魚基因組DNA條帶比較清晰，符合RAPD實驗要求（圖1）。

1.2.2引物篩選及RAPD檢測參照郭勇等三葉崖爬藤RAPD引物篩選[6]。以12尾鯉魚的混合DNA為模板，從50條長度分別為10 bp的隨機引物中（部分引物篩選的結果如圖2所示），篩選出能擴增出清晰、條帶數(shù)量適中的10條引物用于擴增（表1）。RAPD擴增反應程序： 94 ℃ 預變性2 min；然后35個循環(huán)（94℃變性30s，36℃退火 30s，72℃延伸

表110條隨機引物的序列

引物 序列引物序列SBSA10GTGATCGCAGSBSC01TTCGAGCCAGSBSA16AGCCAGCGAASBSC02GTGAGGCGTCSBSB05TGCGCCCTTCSBSC04CCGCATCTACSBSB07GTGACGCAGSBSC07GTCCCGACGASBSB08GTCCACACGGSBSC08TGGACCGGTG

2 min）；最后72 ℃延伸5 min。取 5 μL 擴增產物在1%瓊脂糖凝膠電泳，5 V/cm電壓；用凝膠成像系統(tǒng)進行掃描和分析。

1.2.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析記錄清晰、明亮且重復性好的條帶。將相同遷移距離的條帶看作同一位點，統(tǒng)計總條帶數(shù)與多態(tài)性條帶數(shù)。根據(jù)產物的電泳帶型，在相同遷移率上出現(xiàn)帶的記為1，未出現(xiàn)帶的記為0，只記錄清晰且重復性好的DNA條帶，并計算相關參數(shù)。根據(jù)Nei指數(shù)法[7]用Popgene1.32軟件對2個鯉魚群體的遺傳多樣性指數(shù)進行分析：（1）多態(tài)位點百分率=多態(tài)位點數(shù)/所測位點總數(shù)×100%；（2）遺傳相似系數(shù)：F=2NXY/（NX+NY），其中NXY為2群體的共享位點數(shù)，NX為1群體的位點數(shù)，NY為2群體的位點數(shù)；遺傳距離P：P=1-F；（3）基因流Nm=0.5（1-Gst）/Gst；（4）遺傳分化指數(shù)Gst=（Ht-HPOP）/Ht，其中Ht為總群體的平均多樣度，HPOP為各群體多樣度的平均值。

2結果與分析

2.1RAPD擴增結果

用篩選到的10條引物對2個鯉魚群體的基因組DNA進行PCR擴增，表2列出了10條引物序列的擴增情況。本試驗2個群體中共擴增出100個位點，其中響水河鯉魚群體總條帶數(shù)為47條，其中多態(tài)性條帶有44條，平均多態(tài)位點比例為93.61%；草壩鯉魚群體總條帶數(shù)為53條，其中多態(tài)性條帶有51條，平均多態(tài)位點比例為96.23%，表明該群體遺傳資源豐富，具有較好的遺傳多樣性。

2.22個鯉魚群體的遺傳多樣性

2個鯉魚群體多樣性指數(shù)見表3。響水河鯉魚群體和草壩鯉魚群體Shannon信息指數(shù)（I）分別為0.479 9和0.455 7；Neis基因多樣性指數(shù)（H）分別為0.328 7和0.298 4；等位基因觀察數(shù)（Na）分別為1.821 4和1.910 7，有效等位基因數(shù)（Ne）分別為1.584 3和1.487 9。響水河鯉魚群體的Shannon信息指數(shù)（I）高于草壩鯉魚群體的Shannon信息指數(shù)。表210條RAPD引物對2個鯉魚群體的擴增結果

引物序列總條帶數(shù)（條）多態(tài)性條帶數(shù)（條）多態(tài)性頻率（%）響水河草壩響水河草壩響水河草壩SBSA10GTGATCGCAG05050100SBSA16AGCCAGCGAA666510088.33SBSB05TGCGCCCTTC431375100SBSB07GGTGACGCAG6565100100SBSB08GTCCACACGG666510088.33SBSC01TTCGAGCCAG5656100100SBSC02GTGAGGCGTC5555100100SBSC04CCGCATCTAC5555100100SBSC07GTCCCGACGA6666100100SBSC08TGGACCGGTG4646100100合計4753445193.6196.23

表32個鯉魚群體多樣性指數(shù)

群體Shannon信息指數(shù)Neis基因多樣性響水河0.479 9 0.328 7草壩0.455 7 0.298 4總的0.515 50.341 7

2.3群體間的遺傳變異分析

根據(jù)總的基因多樣性（Ht）和群體內基因多樣性（Hs）可以推算出群體間分化水平（Gst）。本研究的2個鯉魚群體間的遺傳分化系數(shù)Gst為0.082 4，即群體間的遺傳變異占總遺傳變異的8.24%，群體內的遺傳變異占總變異的91.76%，顯示出2個群體間不存在明顯的遺傳變異（表4）。

表42個鯉魚群體遺傳分化與基因流

指標總的基因多

樣性（Ht）群體內基因

多樣性（Hs）遺傳分化

系數(shù)（Gst） 基因流

（Nm）平均 0.341 70.313 5 0.082 4 5.569 0標準差 0.015 60.014 9

2.4群體間的遺傳關系分析

依據(jù)10個有效引物進行PCR擴增的結果，計算出2種鯉魚群體間的遺傳相似性指數(shù)和遺傳距離如表5所示。響水河和草壩2個群體的遺傳相似性系數(shù)為0.958 1，遺傳距離為0.041 9。

表52個鯉魚群體間的相似性（右上角）和遺傳距離（左下角）

群體 響水河草壩響水河 ****0.958 1草壩0.041 9 ****

3討論

3.12個鯉魚群體的遺傳多樣性

RAPD標記操作簡單、方便、快速并且引物具有隨機性[8-9]，現(xiàn)已廣泛應用于水生經濟動物的遺傳多樣性研究，如張濤等對漢江上游鯽魚研究其多態(tài)位點比例為67.77%[10]；方耀林等對長江水系的3個青魚群體進行研究，結果表明多態(tài)性位點比例為75%[11]；勵迪平等報道曼氏無針烏賊的多態(tài)性位點比例為14.6%，平均雜合度Ho為0.032[12]，所得出的曼氏無針烏賊的遺傳多樣性是比較低的；朱學峰研究發(fā)現(xiàn)廣西中華草龜?shù)亩鄳B(tài)位點比例為66.29%，廣西中華草龜?shù)倪z傳多樣性比較豐富，但是個體間的親緣關系比較近，遺傳變異程度很小[13]；張偉等對東南太平洋智利竹魚研究發(fā)現(xiàn)多態(tài)位點比例為98.08%，Neis基因多樣性指數(shù)為0.350 0±0144 0，群體的Shannon信息指數(shù)為0.520 2±0.181 3，遺傳分化指數(shù)Gst為0.031 1，結果表明該海域智利竹魚群體的遺傳多態(tài)性比較高，但群體間不存在明顯的遺傳分化[14]；張學明等研究發(fā)現(xiàn)北海文昌魚Shannon信息指數(shù)為 0.219 0[15]。本試驗篩選出10條引物進行PCR擴增，利用RAPD技術對響水河和草壩鯉魚群體進行遺傳多樣性分析，表明2個群體的平均多態(tài)位點比例分別為93.61%和9623%，Shannon信息指數(shù)分別為0.479 9 、0.455 7，表明響水河和草壩2個鯉魚群體遺傳多樣性比長江銅魚、武漢市場購回的普通鯽魚、漢江上游鯽魚、長江水系青魚、曼氏無針烏賊、廣西中華龜?shù)倪z傳多樣性豐富，但沒有東南太平洋智利竹魚遺傳多樣性豐富。

3.22個鯉魚群體之間的遺傳差異

Thorpe研究認為，同種不同群體間遺傳距離D在0.03～0.2之間，遺傳相似度（I）在0.80～0.97之間，不同物種間遺傳相似度（I）在0.2～0.8之間[16]。本研究中，2個鯉魚群體間的基因分化系數(shù)Gst為0.082 4，表明8.24%的遺傳變異來自于群體間，群體內的遺傳變異占總變異的91.76%，這說明這2個區(qū)域群體之間不存在顯著的遺傳分化，但不同群體間存在一定的遺傳分化。響水河和草壩2個鯉魚群體的遺傳相似度較高（0.958 1），遺傳距離D為0.042 9，大于0.03小于0.2，表明2個群體間存在一定的遺傳分化。本研究獲得的遺傳多樣性數(shù)據(jù)可以對今后紅河州鯉魚遺傳變異水平及其變化趨勢分析提供參考。

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doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2015.01.015