高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定比格犬血漿中的莫諾苷濃度及其藥代動力學(xué)

熊 山， 李敬來， 朱秀清， 王曉英， 呂圭源， 張振清＊

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州310053；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，北京100850）

莫諾苷（結(jié)構(gòu)見圖1）是從中藥山茱萸（Cornus officinalis Sieb.＆Zucc.）中提取分離獲得的環(huán)烯醚萜苷類化合物［1］。研究表明，山茱萸環(huán)烯醚萜苷具有廣泛的藥理活性，包括抗炎、抗腫瘤等，并對心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)有一定的保護作用。其中，莫諾苷能抑制過氧化誘導(dǎo)的神經(jīng)細胞損傷，促進人神經(jīng)上皮瘤細胞（SH-SY5Y）的生長，并提高局灶性腦缺血再灌注大鼠皮層總抗氧化能力，對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷有一定的神經(jīng)保護作用［2-4］。

圖1 莫諾苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of morroniside

在藥效學(xué)實驗的基礎(chǔ)上，前期已經(jīng)應(yīng)用液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS／MS）建立了大鼠血漿中莫諾苷的血藥濃度測定方法，并進行了莫諾苷大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)及組織分布研究。結(jié)果顯示，大鼠單劑量灌胃給藥20 mg／kg，計算得到的主要藥代動力學(xué)參數(shù)：AUC（0-∞）為（587.6±290.7）μg／L·h，Cmax為（334.2±148.0）μg／L，Tmax為（0.6±0.3）h，t1／2為（0.7±0.3）h［5］。在大鼠組織分布研究中，大鼠單劑量灌胃給藥30 mg／kg后，莫諾苷在大鼠體內(nèi)的吸收和分布較快，藥物入血后在體內(nèi)各個組織分布較為廣泛，大部分組織均在45 min達到藥物濃度最高值；藥物在組織中的消除也比較快，6 h后藥物在組織中基本消除完畢［6］。

本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，采用LC-MS／MS技術(shù)建立了比格犬血漿中莫諾苷的檢測方法，優(yōu)化了色譜及質(zhì)譜的各項條件，進行了系統(tǒng)的方法學(xué)驗證，并應(yīng)用于藥代動力學(xué)研究，以探討莫諾苷在比格犬體內(nèi)的變化規(guī)律。

1 實驗部分

1.1 藥品與試劑

莫諾苷（HPLC 測定純度大于98.5%）由首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院藥物研究所提供；芍藥苷對照品（批號：110736-201035，純度：96.5%）購自中國食品藥品檢定研究院；色譜純乙腈和甲醇購自美國Fisher Scientific公司；分析純甲酸鈉購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；水為純凈水。

1.2 儀器與軟件

API 5000 三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)，Analyst 1.5.2質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理軟件（美國AB公司）；Shimadzu LC-20AD 二 元 泵，SIL-20AHT 自 動 進 樣 器，CTO-20A 柱溫箱（日本島津公司）；XW-80A 旋渦混合器（上海青浦滬西儀器廠）；Denver T-214電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；高速低溫離心機（美國Thermo Scientific公司）；DAS 2.0軟件（由皖南醫(yī)學(xué)院孫瑞元和鄭青山教授主編）。

1.3 實驗動物

比格犬5只，雄性，體重（10±2）kg，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供，動物合格證號SCXK（軍）2007-004。

1.4 LC-MS／MS條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：Inertsil ODS-SP柱（50 mm×2.1 mm，5μm）；流動相：水（含1 mmol／L 甲酸鈉，A），乙腈（B）；梯度洗脫：0～0.5 min，5%B～20%B；0.5～1.0 min，20%B～70%B；1.0～3.0 min，70%B～95%B；3.0～3.2 min，95%B～5%B；3.2～6 min，5%B；流速：0.4 mL／min；進樣量：10μL；柱溫：20 ℃；分析時間：6 min。

1.4.2 質(zhì)譜條件

檢測離子對分別選擇：m／z 429.1→267.3（莫諾苷），m／z 503.4→341.2（芍藥苷），兩個化合物的檢測離子均選擇［M＋Na］＋峰。電噴霧離子源（ESI），正離子模式，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；莫諾苷與內(nèi)標(biāo)芍藥苷的離子源電壓（IS）：5 kV；源溫度（TEM）：550 ℃；氣簾氣（CUR）流速：25 L／h；碰撞氣（CAD）流速：12 L／min；錐孔氣流速（Gas1）：45 L／min；去溶劑氣流速（Gas2）：45 L／min；去簇電壓（DP）：180 V；入口電壓（EP）：10 V；碰撞能（CE）：35 V；碰撞池出口電壓（CXP）：15 V。

1.5 血漿樣品處理

取待測比格犬血漿50μL，加入50μL純凈水，混勻，再分別加入100μL芍藥苷溶液（500μg／L）和150μL 甲醇，充分振蕩1 min 后，以14 000 r／min離心10 min，取上清液進樣10μL。

2 結(jié)果

2.1 特異性

空白比格犬血漿、比格犬血漿加標(biāo)樣品和比格犬灌胃后1 h的典型色譜圖見圖2。莫諾苷和內(nèi)標(biāo)芍藥苷的保留時間分別為1.96和2.06 min，峰形良好，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾莫諾苷和內(nèi)標(biāo)的測定。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量限

用純凈水將莫諾苷儲備液稀釋成質(zhì)量濃度為2、10、50、400、2 000 和5 000μg／L 的 系 列 標(biāo) 準(zhǔn) 溶液，取空白比格犬血漿50μL加入50μL 標(biāo)準(zhǔn)溶液混勻，其他操作同1.5 節(jié)所述，LC-MS／MS 方法測定。質(zhì)控樣品的制備、處理及測定同上，標(biāo)準(zhǔn)液的濃度分別為5、200 和4 000μg／L（低、中、高3 種 濃度）。采用加權(quán)最小二乘法計算標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，以莫諾苷與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為Y，以莫諾苷的質(zhì)量濃度為X，得 到 的 回 歸 方 程 為Y ＝0.003 86 X ＋0.014 6（n＝5），權(quán)重因子W ＝1／X2，相關(guān)系數(shù)r＝0.996 6。相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均在《化學(xué)藥物非臨床藥代動力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》（2005年）規(guī)定范圍之內(nèi)。定量限為2μg／L。

圖2 （a）空白犬血漿樣品、（b）空白犬血漿加標(biāo)（莫諾苷2μg／L和內(nèi)標(biāo)）樣品及（c）灌胃莫諾苷（15 mg／kg）后比格犬血漿樣品的色譜圖Fig.2 Chromatograms of（a）blank beagle plasma，（b）blank beagle plasma spiked with morroniside（2μg／L）and internal standard and（c）a beagle plasma sample after intragastric（ig）administration of a 15 mg／kg dose of morroniside

2.3 精密度與準(zhǔn)確度

用空白比格犬血漿配制低、中、高3個濃度（同質(zhì)控樣品）的樣品各5份，連續(xù)測定3 d，用隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計算相應(yīng)的藥物濃度，分別考察批內(nèi)和批間精密度與準(zhǔn)確度。實驗結(jié)果表明，低、中、高3個濃度的批內(nèi)和批間RSD 均小于12%，準(zhǔn)確度為89%～111%，結(jié)果見表1。

2.4 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)

提取回收率為空白血漿中加入藥物經(jīng)提取后的藥物響應(yīng)值與空白血漿處理后加入相同量藥物響應(yīng)值的比值；基質(zhì)效應(yīng)為具有基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品與純標(biāo)準(zhǔn)品的目標(biāo)化合物的響應(yīng)強度的比值。實驗樣品為質(zhì)控樣品（n＝3）。莫諾苷在低、中、高3個濃度的提取回收率 分 別 為（78.65±1.77）%、（83.33±1.14）%、（88.59±1.82）%，回收率符合要求且穩(wěn)定；基質(zhì)效應(yīng)分別為（100.06±5.64）%、（94.92±0.77）%、（83.40±1.89）%，因此可忽略基質(zhì)效應(yīng)的影響。

表1 比格犬血漿中莫諾苷測定方法的精密度和準(zhǔn)確度（n＝5）Table 1 Precision and accuracy of the assay method for morroniside in the beagle plasma（n＝5）

2.5 穩(wěn)定性考察

配制莫諾苷低、中、高3個濃度（5、200和4 000 μg／L）的比格犬血漿樣品（同質(zhì)控樣品，n＝5）。室溫放置6 h后，低、中、高3個濃度對應(yīng)的測定結(jié)果分別為（4.99±0.32）μg／L、（210.20±6.61）μg／L、（3 562.00±132.55）μg／L；上清液樣本在自動進樣器中存放24 h后，對應(yīng)的測定結(jié)果分別為（5.06±0.38）μg／L、（214.40±7.30）μg／L、（3 718.00±135.54）μg／L；莫諾苷血漿樣本冷凍20 d后，對應(yīng)的測定結(jié)果分別為（4.98±0.40）μg／L、（189.20±6.30）μg／L、（3 548.00±133.30）μg／L。結(jié) 果 表明，在上述穩(wěn)定性考察條件下，莫諾苷各濃度的測定值與實際值相近，準(zhǔn)確度高，表明莫諾苷在上述貯存及測定過程中均是穩(wěn)定的。

2.6 莫諾苷在比格犬體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究［7］

按照莫諾苷5、15和45 mg／kg的給藥劑量單次給予比格犬灌胃給藥。

將5只比格犬編號并稱重，分3個周期分別給予3個劑量的藥物，清洗期為1周，自由飲水。于給藥前禁食12 h，自由飲水。于給藥前及給藥后5 min、15 min、30 min、45 min、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h由腿靜脈分別取血1 mL，于3 000 r／min離心15 min，將血漿于-30 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

比格犬單次灌胃給予莫諾苷后的平均血藥濃度-時間曲線見圖3；將動物種屬、給藥劑量、給藥方式和測得的血藥濃度等信息輸入DAS2.0軟件，處理后得到主要藥代動力學(xué)參數(shù)見表2。對藥-時曲線下的面積AUC（0-∞）和劑量進行線性回歸，回歸方程為Y＝216.11 X＋632.78（Y：AUC（0-∞），μg／L·h；X：劑量，mg／kg），相關(guān)系數(shù)r 為0.999 7，說明比格犬灌胃莫諾苷后，呈線性藥代動力學(xué)過程。

表2 比格犬灌胃3個劑量莫諾苷后的主要動力學(xué)參數(shù)（mean±SD，n＝5）Table 2 Pharmacokinetic parameters of morroniside after ig administration of three level doses in beagles（mean±SD，n＝5）

圖3 比格犬單次灌胃莫諾苷的平均血藥濃度-時間曲線（mean±SD，n＝5）Fig.3 Mean concentration-time curves of morroniside after single ig administration in beagles（mean±SD，n＝5）

3 結(jié)論

本研究運用LC-MS／MS聯(lián)用技術(shù)建立了比格犬血漿中莫諾苷血藥濃度的檢測方法，該方法簡便、特異性強，為莫諾苷的動力學(xué)研究提供了穩(wěn)定、可靠、方便的檢測手段。研究發(fā)現(xiàn)，莫諾苷在比格犬體內(nèi)的AUC（0-∞）與劑量呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，提示其為線性動力學(xué)過程，并且主要的藥代動力學(xué)參數(shù)MRT、t1／2z、Tmax、CLz、和Vz在各劑量組中無顯著性差異。本研究建立的檢測方法以及比格犬體內(nèi)的動力學(xué)結(jié)果為今后全面評價莫諾苷的體內(nèi)外代謝性質(zhì)打下了良好的基礎(chǔ)。

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