基于金納米顆粒的比色法檢測大腸桿菌O157∶ H7

周麗霞， 肖 勇， 楊耀東

(中國熱帶農業(yè)科學院椰子研究所，海南省熱帶油料作物生物學重點實驗室，海南 文昌571339)

大腸桿菌(Escherichia coli)O157∶ H7 屬于腸桿菌科埃希氏菌屬，是一種毒性較強的食源性病原菌，主要通過飲用水、牛奶等食品進行傳播［1-5］，人體感染該類病原菌會患有腹瀉、出血性結腸炎等疾病，此外還可引發(fā)溶血性尿毒綜合癥及血栓性血小板減少紫斑等嚴重并發(fā)癥，嚴重者可導致死亡［6-7］。因此，快速、靈敏的檢測和分析此類感染性病原菌對于疾病防治、環(huán)境保護等都具有十分重要的意義。傳統(tǒng)的病原菌檢測方法通常建立在免疫學和細菌分離的基礎上，如細胞計數法、酶聯(lián)免疫吸附法、PCR 分析法等，該類方法具有較高的準確度，但也存在很多缺點，如細菌培養(yǎng)費時，檢測不靈敏，分離過程中造成菌數目的損失等［8-10］。因此，傳統(tǒng)的檢測方法已遠不能滿足現代生活和醫(yī)學應用中對大腸桿菌O157∶ H7 快速靈敏檢測的要求，探索一種快速、靈敏、低成本和易操作的病原菌檢測新方法對于預防疾病傳播和環(huán)境保護都具有深遠的意義。

隨著納米科技與生物學的深入發(fā)展，金納米顆粒作為納米材料的重要成員之一，其在量子尺寸效應、光穩(wěn)定性和生物相容性等方面的獨特優(yōu)勢，已在微生物和細胞檢測領域得到了廣泛應用［11］。本試驗利用抗體功能化金納米顆粒與大腸桿菌之間的聚合，發(fā)展了一種基于金納米顆粒的比色法，并用此方法分別對緩沖液體系和礦泉水中大腸桿菌O157∶H7 進行快速檢測，以期為多種食源性病原菌的快速、靈敏檢測提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

HAuCl4購于天津市化學試劑研究所;檸檬酸三鈉購于天津市化學試劑一廠;多克隆羊抗大腸桿菌O157∶ H7 抗體、溶菌肉湯(LB)培養(yǎng)基、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺(EDC·HCl)購于北京鼎國生物科技有限公司;E.coliO157∶ H7 購于廣州環(huán)凱生物科技有限公司;E.coliO149 購于廣東省微生物研究所;E.coliDH5α 購于廣東省微生物研究所微生物菌種保藏中心。

JEOL-1230 型透射電子顯微鏡購自日本JEOL公司;高速離心機購于日本Hitachi 公司;納米粒度及Zeta 電位儀(Nano-ZS)購于英國Malvern 公司;Lambda 900UV 光譜儀購自Perkin Elmer 公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 金納米顆粒的制備、生物修飾及表征 參照文獻［12］報道的方法制備金納米顆粒，在100 ml 的燒杯中，加入濃度為0.01%的氯金酸50 ml，加熱攪拌至沸騰后，加入濃度為1.00%的檸檬酸三鈉2 ml，繼續(xù)保持沸騰并反應15 min，溶液顏色變?yōu)榫萍t色，停止加熱并使其自然冷卻至室溫，即合成了金納米顆粒。

參照文獻［13］、［14］方法進行納米顆粒的生物修飾。取1 ml 金納米顆粒溶液，離心后去掉上清液，向體系中加入10 μl 巰基丙酸，輕輕混勻后室溫下放置4 d，高速離心后用pH 為7.4 的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌一次，然后將顆粒分散在1 ml PBS 中。向體系中加入3.5 mgNHS，于25 ℃下反應30 min，再加入50 μl 1 mg/ml 的多克隆羊抗大腸桿菌O157∶ H7抗體和3.5 mg EDC·HCl，于25 ℃下反應3 h，待反應終止后離心除去上清液，然后分散在PBS 緩沖液中，并避光于4 ℃保存。采用納米粒度儀及Zeta 電位儀、透射電鏡和紫外吸收對修飾前后的顆粒進行表征［15］。

1.2.2E.coliO157∶ H7 的培養(yǎng) 將含有0.5 g 酵母提取物、1.0 g 蛋白胨和0.5 g NaCl 的LB 培養(yǎng)基粉末溶于100 ml 水中，于121 ℃下高溫滅菌30 min［16］。分別將E.coliO157∶ H7、E.coliO149 和E.coliDH5α 在液體培養(yǎng)基中于37 ℃培養(yǎng)2.5 ～3.0 h，用涂板計數法計算初始菌濃度，并將培養(yǎng)好的菌懸液放在4 ℃保存。

1.2.3E.coliO157∶ H7 的檢測 將1 ml 6.3 ×106個E.coliO157∶ H7 菌懸液8 000 r/min離心5 min，去除上清液后，加入1 ml pH 為7.4 的PBS 緩沖液沖洗2 次，并最終將菌充分分散在1 ml PBS 緩沖液中。根據梯度濃度稀釋法，得到濃度為1 ml 6.3 ×101～6.3 ×106個菌懸液。

分別取100 μl 終濃度為9.3 mg/ml的抗體功能化金納米顆粒，加入400 μl 上述不同濃度的菌懸液，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育1 h。根據抗原-抗體的免疫特異性結合，原本分散的金納米顆粒集中聚合在菌的表面，根據金納米顆粒的尺寸效應，使得混合體系的顏色發(fā)生變化。由于緩沖液中目標菌的濃度不同，顆粒的聚合程度也不同，混合體系的顏色也逐漸由紅色變?yōu)樗{色，從而實現了對大腸桿菌O157∶ H7快速、直觀地檢測。

1.2.4 食品中大腸桿菌O157∶ H7 的檢測 為考察該檢測方法的實用性，從當地超市買了瓶裝礦泉水，人為加入目標菌后直接使用。將1 ml 4.1×106個E.coliO157∶ H7 菌懸液8 000 r/min離心5 min，去除上清液后，加入1 ml 礦泉水沖洗2 次，并最終將菌充分分散在1 ml 礦泉水中。根據梯度濃度稀釋法，得到濃度為1 ml 4.1×101～4.1×106個菌懸液。

2 結果與分析

2.1 金納米顆粒的表征

合成的金納米顆粒形貌如圖1 所示，顆粒呈規(guī)則的球形，大小均勻且分散性較好，另外，納米粒度儀測定出金納米顆粒的平均直徑約為(12.3 ±2.0)nm，該結果與電鏡圖的大小基本吻合，有利于顆粒的下一步應用。圖2 為金納米顆粒修飾巰基丙酸前后的吸收光譜，測得其最大熒光發(fā)射峰位于520 nm左右。當顆粒表面修飾了巰基丙酸后，表面有大量的羧基基團，其電位約為-44.7 mV(圖3)，這一結果表明，顆粒表面成功地修飾了大量巰基丙酸。

圖1 金納米顆粒的透射電鏡圖Fig.1 Transmission electron microscopic(TEM)image of gold nanoparticles

圖2 金納米顆粒修飾前后的吸收光譜圖Fig.2 Absorption spectrum of gold nanoparticles and modified gold nanoparticles

圖3 羧基化金納米顆粒的Zeta 電位圖Fig.3 Zeta potential spectrum of carboxyl modified nanoparticles

2.2 大腸桿菌O157∶ H7 的檢測

2.2.1 可行性考察 基于金納米顆粒的比色法對1 ml 6.3 ×105個大腸桿菌純培養(yǎng)物陽性對照和陰性對照(陰性對照1:以無菌緩沖液取代大腸桿菌O157∶ H7;陰性對照2:以裸金納米顆粒取代功能化金納米顆粒)進行可行性考察。結果顯示，在陽性對照組中，抗體功能化金納米顆粒與目標菌共孵育后，體系顏色變?yōu)樗{色，而在2 個陰性對照中，體系顏色仍為紅色，幾乎沒有發(fā)生顏色變化，這一結果說明該方法檢測大腸桿菌O157∶ H7 是可行的，同時表明抗體與金納米顆粒的交聯(lián)效果較好。

2.2.2 大腸桿菌O157∶ H7 的檢測結果 基于金納米顆粒的比色法對梯度濃度為1 ml 6.3 ×101～6.3 ×106個大腸桿菌O157∶ H7 進行檢測，通過溶液顏色的變化，來考察方法的檢測靈敏度。結果顯示，當菌液濃度為1 ml 6.3 ×102個時，體系顏色由紅色變?yōu)樽仙S著菌濃度的增大，顏色逐漸變?yōu)樗{色，因此，該方法檢測下限為1 ml 6.3 ×102個大腸桿菌O157∶ H7。為進一步驗證這一結果，取適量濃度為1 ml 6.3 ×103個大腸桿菌O157∶ H7 與功能化金納米顆粒的混合液滴在銅網上，室溫下放置24 h 陰干，在透射電鏡下觀察金納米顆粒與大腸桿菌O157∶ H7的形態(tài)(圖4)，發(fā)現大腸桿菌O157∶ H7表面成功聚集了一定量的金納米顆粒。

圖4 金納米顆粒與大腸桿菌O157∶ H7 的透射電鏡圖Fig.4 TEM image of the mixture of E.coli O157 ∶ H7 and gold nanoparticles

2.3 檢測方法的特異性考察

為進一步評價該檢測方法的特異性，現分別采用E.coliDH5α(1 ml 5.7 ×105個)和E.coliO149(1 ml 7.2 × 105個)作為非目標菌，與大腸桿菌O157∶ H7經過同樣的處理方法后，加入抗體功能化金納米顆粒，并于37 ℃恒溫孵育1 h?？疾旖Y果顯示，當分別采用無菌緩沖液、E.coliO149、E.coliDH5α 代替目標菌(E.coliO157∶ H7)時，體系顏色均未發(fā)生變化，而加入大腸桿菌O157∶ H7 時，體系顏色從紅色變?yōu)樗{色，由此可見，該方法的檢測特異性較好。同時，我們測定了每個體系的紫外吸收光譜，如圖5 所示，當體系中加入大腸桿菌O157∶ H7時，金納米顆粒520 nm 吸收峰降低，隨著顆粒的聚集程度增大，在630 nm 出現新的吸收峰。表明只有大腸桿菌O157∶ H7 誘導金納米顆粒聚集，而其他非目標菌未與功能化顆粒結合，這一結果進一步證明該方法具有較好的檢測特異性，未出現抗體與非目標菌的交叉反應。

圖5 不同菌存在時金納米顆粒的吸收光譜Fig.5 Absorption spectra of gold nanoparticles in the presence of different bacteria

2.4 食品中大腸桿菌O157∶ H 7 的檢測

為證明基于金納米顆粒的比色法可用于檢測食品中的大腸桿菌O157∶ H7，用礦泉水配制了400 μl終濃度為1 ml 4.1 × 101～4.1 × 106個大腸桿菌O157∶ H7，并分別加入100 μl 抗體功能化的金納米顆粒，于37 ℃恒溫中孵育1 h。結果顯示，當菌濃度為1 ml 4.1 ×102個時，體系顏色由紅色變?yōu)樽仙?，隨著菌濃度的增大，體系顏色逐漸變?yōu)樗{色。為進一步證明該檢測方法的靈敏度，分別對1 ml 4.1 ×101個和1 ml 4.1 ×102個菌濃度的反應體系進行光譜分析，結果(圖6)顯示，1 ml 4.1 ×101個菌濃度的反應體系在520 nm 有吸收峰，630 nm 處無鋒，而1 ml 4.1 ×102個菌濃度的反應體系在520 nm的吸收峰降低，隨著顆粒的聚集程度增大，在630 nm 出現新的吸收峰。表明應用該比色法對礦泉水樣本進行檢測，其靈敏度為1 ml 4.1 ×102個 大腸桿菌O157∶ H7。

圖6 不同濃度大腸桿菌O157∶ H7 存在時金納米顆粒的吸收光譜Fig.6 Absorption spectra of gold nanoparticles in the presence of different concentrations of E.coli

3 結論

基于抗體功能化的金納米顆粒，發(fā)展了一種直觀、簡便的比色分析法用于大腸桿菌O157∶ H7 的檢測。該方法巧妙的運用了金納米顆粒的量子尺寸效應，由于聚集程度不同，其吸收光譜發(fā)生紅移，從而引起溶液顏色發(fā)生不同的變化，實現了對緩沖體系和礦泉水中目標菌的快速檢測。若采用針對其他病原菌以及細胞的特異性抗體，有望成為一種通用的方法用于食品檢測、疾病診斷和環(huán)境保護等領域中多種病原菌與細胞的測定與分析。

［1］ HE X X，ZHOU L X，HE D G，et al.Rapid and ultrasensitiveE.coliO157∶ H7 quantitation by combination of ligandmagnetic nanoparticles enrichment with fluorescent nanoparticles based two-color flow cytometry［J］.Analyst，2011，136:4183-4191.

［2］ 侯偉峰，謝 晶，藍蔚青，等.植酸對大腸桿菌抑菌機理的研究［J］.江蘇農業(yè)學報，2012，28(2):443-447.

［3］ 張麗霞，賈海燕.一種簡便高效大腸桿菌感受態(tài)細胞制備方法［J］.江蘇農業(yè)科學，2013，41(12):41-42.

［4］ 丁月云，余大華，孟 云，等.中草藥復方對豬常見致病菌的體外抑菌試驗［J］.江蘇農業(yè)科學，2013，41(11):236-238.

［5］ 董永軍，王憲文，王麗榮.雞致病性大腸桿菌的分離鑒定及藥敏試驗［J］.江蘇農業(yè)科學，2013，41(9):192-194.

［6］ MAGLIULO M，SIMONI P，GUARDIGLI M，et al.A rapid multiplexed chemiluminescent immunoa ssay for the detection ofEscherichia coliO157∶ H7，Yersinia enterocolitica，Salmonella typhimurium，and Listeria monocytogenes pathogen bacteria［J］.J Agric Food Chem，2007，55:4933-4939.

［7］ DEISINGH A K，THOMPSON M.Strategies for the detection ofEscherichia coliO157∶ H7 in foods［J］.J Appl Microbiol，2004，96:419-429.

［8］ CHAPMAN P A，MALO A T，SIDDONS C A，et al.Use of commercial enzyme immune assays and immunomagnetic separation systems for detectingEscherichia coliO157 in bovine fecal samples［J］.Appl EnViron Microbiol，1997，63:2549-2553.

［9］ RODA A，PASINI P，BARALDINI M，et al.Chemiluminescent imaging of enzyme-labelled probes using an optical microscope-videocamera luminograph［J］.Anal Biochem，1998，257:53-62.

［10］ EKINS R P.Ligand assays:from electrophoresis to miniaturized microarrays［J］.Clin Chem，1998，44:2015-2030.

［11］ SINGH A K，SENAPATI D，WANG S G，et al.Gold nanorod based selective identification ofEscherichia colibacteria using twophoton rayleigh scattering spectroscopy［J］.ACS Nano，2009，3(7):1906-1912.

［12］ 王 靜，易中周，李自靜.金納米粒子的制備及表征研究［J］.四川化工，2011，14(3):8-10.

［13］ LU Q Z，LIN H L，GE S T，et al.Wireless，remote-query，and high sensitivityEscherichia coliO157∶ H7 biosensor based on the recognition action of concanavalin A［J］.Anal Chem，2009，81:5846-5850.

［14］ LU W T，ARUMUGAM S R，SENAPATI D，et al.Multifunctional oval-shaped gold-nanoparticle-ba sed selective detection of breast cancer cells using simple colorimetric and highly sensitive two-hpoton scattering assay［J］.ACS Nano，2010，4(3):1739-1749.

［15］ 周麗霞，何定庚，何曉曉，等.基于二氧化硅熒光納米顆粒與核酸染料SYBR Green I 的雙色顯微成像技術用于E.coliO157∶ H7的檢測［J］.高等學?；瘜W學報，2011，32(10):2274-2279.

［16］ QIN D L，HE X X，WANG K M，et al.Using fluorescent nanoparticles and SYBR Green I based two-color flow cytometry to determineMycobacterium tuberculosisavoiding false positives［J］.Biosensord and Bioelectronics，2008，24:626-631.