破碎小球藻細(xì)胞提取生物油脂新方法

李 亮，李洋洋，黃遠(yuǎn)星，宋翠紅，程豪奇

(1.上海理工大學(xué)環(huán)境與建筑學(xué)院，上海200093;2.中國(guó)石油化工股份有限公司洛陽(yáng)分公司，河南洛陽(yáng)471012)

隨著世界能源的加劇消耗以及實(shí)現(xiàn)低碳經(jīng)濟(jì)的迫切需要，生物質(zhì)能源引起了全世界人們的廣泛關(guān)注［1-3］.生物質(zhì)能源通過(guò)植物的光合作用將太陽(yáng)能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能，具有可再生、轉(zhuǎn)化效率高、對(duì)環(huán)境污染小等優(yōu)點(diǎn)，具有廣闊的應(yīng)用前景［4］.由于目前以油料作物為原料的生物柴油產(chǎn)率低、占用大量耕地等條件的限制［5］，以及藻類具有可以大規(guī)模人工培養(yǎng)、環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)、生長(zhǎng)周期短、單位面積生物量大的特點(diǎn)［6-9］，使得藻類成為制備生物油燃料的良好材料.由于小球藻倍增時(shí)間短，與其他高油脂密度微藻相比，普通小球藻在供給生物油脂方面有一定的競(jìng)爭(zhēng)力［10］.

為了更好地利用微藻產(chǎn)油，首先要對(duì)微藻藻體破壁，由于微藻細(xì)胞較小、且具細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，油脂都包裹在微藻細(xì)胞內(nèi)［11］，因此采用細(xì)胞破壁后進(jìn)行提取是目前利用微藻生產(chǎn)生物能源的一個(gè)難點(diǎn).目前國(guó)內(nèi)外微藻油脂破壁提取技術(shù)主要包括:勻漿器破碎［12］，玻珠研磨機(jī)(砂磨機(jī))研磨［13］，超聲波破碎［14-15］，微波破碎［16］，高壓釜加溫加壓破碎［17-18］，反復(fù)凍融法破碎［19］，有機(jī)溶劑裂解［20］，滲透壓沖擊［21］，酶裂解［22］，脈沖電磁場(chǎng)法［23］等.細(xì)胞破碎是從藻類中提取微生物油脂必不可少的一個(gè)環(huán)節(jié)，在實(shí)際的生產(chǎn)和應(yīng)用過(guò)程中，人們會(huì)根據(jù)不同的藻類種屬，藻類生長(zhǎng)狀態(tài)，不同的加工要求和不同的目標(biāo)提取物而靈活選用合適的細(xì)胞破碎技術(shù).

在自然水體治理過(guò)程中，經(jīng)常利用臭氧預(yù)氧化法來(lái)提高混凝除藻效果，有效地提高了原水中藻類去除率，減輕后續(xù)過(guò)濾工藝的堵塞情況［24-25］.目前利用臭氧氧化能力來(lái)破碎藻類細(xì)胞提取油脂的研究鮮有報(bào)道.本研究在傳統(tǒng)臭氧預(yù)氧化水體中藻類的研究基礎(chǔ)之上，以加壓-減壓循環(huán)過(guò)程輔助臭氧氧化法，旨在探索一種破碎小球藻細(xì)胞壁的新方法.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

試驗(yàn)中所采用的小球藻藻種由武漢中科院水生生物研究所購(gòu)得.試驗(yàn)中所采用正己烷和乙酸乙酯為 HPLC 純，其余試劑如 NaNO3、K2HPO4、MgSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、檸檬酸、檸檬酸鐵銨、EDTANa2、Na2CO3等為化學(xué)純，均由國(guó)藥試劑有限公司購(gòu)得.FAME標(biāo)準(zhǔn)樣品(GLC-10)由美國(guó)Sigma-Aldrich公司購(gòu)得.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 小球藻培養(yǎng)

小球藻用逐級(jí)放大法進(jìn)行培養(yǎng)，第1步將小球藻藻種與BG11培養(yǎng)基按照體積比1∶5進(jìn)行稀釋培養(yǎng)2周.然后將所得藻液與BG11培養(yǎng)基按照1∶10進(jìn)行再次稀釋后培養(yǎng)2周.最后將所得藻液與BG11培養(yǎng)基按照1∶100進(jìn)行稀釋后培養(yǎng)2月.所得藻液即可應(yīng)用于破碎試驗(yàn)中.整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程在塞福PGX-350B智能培養(yǎng)箱中進(jìn)行，溫度為25℃，光照強(qiáng)度為5 000 lx，光暗時(shí)間各12 h.

1.2.2 壓力輔助臭氧法

圖1為本試驗(yàn)所采用的裝置圖.均勻量取250mL培養(yǎng)好的藻液，50 mL用以測(cè)定初始總固體懸浮物(total suspended soilds，TSS)質(zhì)量濃度，另外200 mL置于高壓反應(yīng)釜中，調(diào)節(jié)機(jī)械攪拌器速度為120 r·min-1，轉(zhuǎn)動(dòng)5 min將溶液混勻.打開臭氧發(fā)生器，流量控制在2 L·min-1，臭氧與空氣混合氣體由空壓機(jī)泵入高壓反應(yīng)釜中，觀察壓力表，達(dá)到一定壓力后保持5 s后由釋壓閥突然釋放，這一過(guò)程稱為1個(gè)循環(huán).經(jīng)過(guò)不同壓力和循環(huán)數(shù)處理后打開反應(yīng)釜，所得小球藻藻液進(jìn)行測(cè)定.

圖1 試驗(yàn)裝置圖

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 常規(guī)項(xiàng)目

TSS、化學(xué)需氧量 (chemical oxygen demand，COD)、氨氮、亞硝態(tài)氮、硝態(tài)氮、總氮、溶解性磷和總磷按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)分析方法測(cè)定.

1.3.2 油脂產(chǎn)率

在破碎后小球藻藻液中加入正己烷和乙酸乙酯體積比1∶1的混合有機(jī)溶劑50 mL，分3次萃取，上層有機(jī)相14 000 r·min-1離心30 min，取上層有機(jī)相于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上蒸法至有機(jī)溶劑全部揮發(fā)，稱重計(jì)算出油率.油脂產(chǎn)率以提取物占小球藻干重的百分比計(jì)算.

1.3.3 氣相色譜-質(zhì)譜分析(GC-MS)條件

將油脂溶解在1 mL正己烷中，隨后加入200 μL濃度為2 mol·L-1的氫氧化鉀甲醇溶液，劇烈攪拌2 min后分層，收集上層有機(jī)相，并利用GC-MS(Agilent GC 7890-MS 5975)進(jìn)行成分分析.所用色譜柱為HP-5MS毛細(xì)管色譜柱(FS 30 m×ID 0.25 mm×DF 0.25 μm)，載氣為高純氦氣(99.999%)，不分流進(jìn)樣，載氣流速為1.0 mL·min-1，進(jìn)樣口溫度為270℃;程序升溫方式，初溫50℃，保持1 min，第1階段升溫速率15℃·min-1，升至180℃;第2階段升溫速率7℃·min-1，升至230℃;第3階段以30℃·min-1的速率升至300℃，保持10 min.MS為掃普模式，質(zhì)量范圍為20～500 u.將所得譜峰與NIST標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)及標(biāo)準(zhǔn)樣品對(duì)比進(jìn)行定性分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 壓力輔助臭氧法破碎效果分析

在最大壓力為0.8 MPa、加壓-減壓循環(huán)數(shù)為80次的條件下對(duì)培養(yǎng)所得小球藻藻液進(jìn)行破碎試驗(yàn).破碎后，溶液中氨氮從小于0.4 mg·L-1上升至0.9 mg·L-1，亞硝酸鹽從 6.90 mg·L-1下降至0.06 mg·L-1，硝酸鹽從 191 mg· L-1上升至201 mg·L-1，總氮質(zhì)量濃度從216 mg·L-1上升至284 mg·L-1.對(duì)數(shù)據(jù)研究后發(fā)現(xiàn)，無(wú)機(jī)氮質(zhì)量濃度在破碎后僅僅上升了4.1 mg·L-1，但是總氮質(zhì)量濃度上升了68 mg·L-1，這表明溶液中有大量有機(jī)氮生成，這可能是由于小球藻細(xì)胞破碎后細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外流引起的.除此之外，溶解性磷和總磷質(zhì)量濃度分別由初始的0.07和 1.6 mg·L-1上升至 0.31 和14.3 mg·L-1，這也間接證明了小球藻細(xì)胞破碎后有大量細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)溶解進(jìn)入水相中.

2.2 不同壓力對(duì)油脂產(chǎn)率的影響

在細(xì)胞破碎過(guò)程中，壓強(qiáng)的增大促使細(xì)胞內(nèi)外壓力差增大，高壓促使細(xì)胞產(chǎn)生裂縫，此時(shí)突然加壓使小球藻細(xì)胞內(nèi)含物通過(guò)狹縫瞬間釋放，最終使細(xì)胞破碎.另一方面，臭氧的氧化性直接破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，也可以促使細(xì)胞破裂［26］，這都有利于破碎小球藻細(xì)胞.不同壓力對(duì)小球藻細(xì)胞破碎及油脂產(chǎn)率的影響結(jié)果見圖2，循環(huán)次數(shù)為80.

圖2 不同壓力對(duì)小球藻細(xì)胞破碎及油脂產(chǎn)率的影響

溶解性COD可以反映水中有機(jī)物含量的多少，從圖2中可以看出壓力的增加促使溶液中溶解性COD含量的增加，這在一定程度上反應(yīng)了藻類細(xì)胞的破碎程度.當(dāng)壓力從0.6 MPa增加到0.8 MPa時(shí)，COD數(shù)值顯著增加，這說(shuō)明小球藻細(xì)胞破碎程度隨著壓力的增加而增加.此外，隨著壓力的逐漸增大，小球藻的油脂產(chǎn)率先升高后下降.壓力在0.6 MPa時(shí)油脂產(chǎn)率達(dá)到最大的26.7%，這與曹春暉等關(guān)于小球藻的油脂含量研究中小球藻的油脂含量一般為8%～27%相一致［27］.但隨著壓力的進(jìn)一步增加，出油率有所下降.這可能是因?yàn)樵谳^為劇烈的條件，小球藻細(xì)胞破碎后進(jìn)入水相中有機(jī)物被進(jìn)一步氧化生成某些中間產(chǎn)物［28］.

2.3 循環(huán)數(shù)對(duì)油脂產(chǎn)率的影響

0.6 MPa壓力下不同循環(huán)數(shù)對(duì)小球藻細(xì)胞破碎及油脂產(chǎn)率的影響見圖3.從圖3中看出，當(dāng)加壓-減壓循環(huán)數(shù)從20次增加到40次并最終增加到80次時(shí)，小球藻產(chǎn)油率從11.8%增加至17.6%并最終增加到26.7%.顯而易見循環(huán)數(shù)的增加，小球藻的出油率隨之增加.在這個(gè)過(guò)程中，溶解性COD的變化比較小，位于213～275 mg·L-1范圍內(nèi).這可能與小球藻細(xì)胞破碎后流出物質(zhì)的性質(zhì)有關(guān)，某些有機(jī)物的溶解度比較小，難以進(jìn)入水相中.循環(huán)次數(shù)的增加意味著小球藻加壓-減壓過(guò)程次數(shù)的增多，加壓-減壓的過(guò)程中會(huì)進(jìn)一步增加細(xì)胞之間的碰撞程度，并且增加臭氧與小球藻的接觸幾率，這樣做會(huì)使細(xì)胞破碎的更完全，細(xì)胞質(zhì)更容易流出，更加有利于油脂的提取.

圖3 不同循環(huán)數(shù)對(duì)小球藻細(xì)胞破碎及油脂產(chǎn)率的影響

2.4 油脂成分分析

生物柴油是以生物油脂(包括植物脂肪，動(dòng)物脂肪等)與醇類物質(zhì)(通常為甲醇，乙醇)通過(guò)酯交換反應(yīng)得到的長(zhǎng)鏈脂肪酸甲酯.醇類物質(zhì)通常選甲醇，這是由于甲醇的價(jià)格較低，同時(shí)其碳鏈短、極性強(qiáng)，能夠很快與脂肪酸甘油酯發(fā)生反應(yīng)，且堿性催化劑易溶于其中.圖4為制備生物柴油制備的反應(yīng)方程式［29］，甲醇在催化劑下，與生物油脂中的甘油三酯發(fā)生酯交換反應(yīng)，生成甘油和脂肪酸甲酯，甘油被分離后，得到的脂肪酸甲酯就是生物柴油.在酯交換反應(yīng)中，可以用酸、堿或酶做催化劑進(jìn)行催化［30］.

利用壓力輔助臭氧法在0.8 MPa、80次循環(huán)數(shù)的條件下破碎小球藻細(xì)胞，經(jīng)過(guò)萃取、濃縮、酯化等步驟后由GC-MS測(cè)定所得脂肪酸甲酯成分，其結(jié)果如表1所示.結(jié)果表明，色譜出峰主要集中在10～20 min范圍內(nèi)，其主要成分有:十四烷酸甲酯、13-甲基-十四烷酸甲酯、9-甲基-十四烷酸甲酯、十六烷酸甲酯、14-甲基-十六烷酸甲酯及十八烷酸甲酯等.十六酸甲酯和十八酸甲酯為其主要成分，其相對(duì)比例分別高達(dá)40.4%及48.6%.根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果可以推論小球藻破碎后其成分中長(zhǎng)鏈脂肪酸有十四烷酸、13-甲基-十四烷酸、9-甲基-十四烷酸、十六烷酸、14-甲基-十六烷酸及十八烷酸等，其中十六烷酸和十八烷酸為其主要成分，與文獻(xiàn)中利用其他方法提取的小球藻成分類似［31-32］.值得一提的是，本方法破碎后的小球藻中并未能檢測(cè)到大量的不飽和脂肪酸，這可能與臭氧的強(qiáng)氧化性有關(guān)，不飽和脂肪酸在處理過(guò)程中被氧化生成了小分子有機(jī)物.

圖4 制造生物柴油的酯交換反應(yīng)

表1 小球藻提取物主要成分分析結(jié)果

3 結(jié)論

壓力輔助臭氧法可以成功破碎小球藻細(xì)胞，破碎后體系中氨氮、硝酸鹽、有機(jī)氮含量明顯上升，亞硝酸鹽下降，總氮含量上升.溶解性磷和總磷的含量也有明顯增加.壓力和循環(huán)數(shù)對(duì)小球藻破碎有著明顯的影響.水相中溶解性COD含量隨著壓力增大、循環(huán)數(shù)增加而增加.經(jīng)試驗(yàn)得到的臭氧加壓法提取小球藻油最佳工藝條件為壓力0.6 MPa，80次循環(huán)，在此條件下小球藻油有最大的萃取率26.7%.通過(guò)對(duì)小球藻藻油的GC-MS檢測(cè)，確定了小球藻中多種脂肪酸，包含十四烷酸、13-甲基-十四烷酸、9-甲基-十四烷酸、十六烷酸、14-甲基-十六烷酸及十八烷酸等，其主要成分為C16∶0與C18∶0，相對(duì)比例高達(dá)40.4%及48.6%.本研究結(jié)果為提取微藻油脂提供了一種全新的可行方法.與傳統(tǒng)的微藻藻油提取工藝相比，臭氧加壓法萃取工藝簡(jiǎn)單，步驟少，相同條件下處理量大，同時(shí)在常溫下進(jìn)行試驗(yàn)可以減少高溫條件下造成的油脂損失.

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