In Situ PLA技術原位分析MTA1與NuRD復合體其他組分的相互作用△

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都醫(yī)科大學附屬北京朝陽醫(yī)院醫(yī)學研究中心，北京 100020

國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所分子腫瘤學國家重點實驗室，北京100021

都醫(yī)科大學附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院婦科腫瘤，北京100006

MTA1是1993年Pencil等利用差異cDNA文庫篩選技術，從具有轉(zhuǎn)移潛能的大鼠乳腺癌細胞株13762NF中篩選分離出的一個乳腺癌轉(zhuǎn)移相關基因[1]。隨后大量研究表明MTA1普遍高表達于乳腺癌、肺癌、腸癌、胃癌、食管癌、胰腺癌、卵巢癌、胸腺癌、肝癌、子宮內(nèi)膜癌、前列腺癌等大多數(shù)類型的人類腫瘤組織中，參與了腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移、血管生成、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、細胞增殖、放化療耐受等眾多惡性行為的調(diào)控過程[2]。

MTA1/NuRD復合體是目前發(fā)現(xiàn)的MTA1參與腫瘤調(diào)控的一個最主要機制。NuRD即核小體重塑及組蛋白去乙酰化復合體，它由HDAC1、HDAC2、RbAp46、RbAp48、MTA1、MBD3 及 Mi2七種蛋白組成[3]。通過NuRD復合體MTA1在細胞核內(nèi)抑制了多種腫瘤抑癌基因的表達，如BRCA1[4]、p21 WAF1[5]、HIC1[6]等。但最近研究表明MTA1不僅定位于胞核，在胞質(zhì)中也有明顯的分布，我們課題組的大量研究數(shù)據(jù)也充分證明了這一點。對于胞質(zhì)定位的MTA1是否也存在于NuRD復合體中并通過其發(fā)揮功能這一疑問，至今還未見報道。

In Situ PLA技術是瑞典的Olink Bioscience公司發(fā)明的一項可以用于原位定量檢測蛋白相互作用的新技術。鄰位連接技術（proximity ligation assay，PLA）的原理是使用一對標記有一段寡聚脫氧核苷酸（單鏈DNA）的二抗探針（PLA探針）分別識別兩種已經(jīng)結合了不同目的蛋白的一抗，如果這兩種目的蛋白具有相互作用，那么此時兩個PLA探針之間的距離就會非常接近（＜40 nm），即產(chǎn)生了所謂的鄰近效應（proximity）。此時，通過加入一段分別與連接在抗體上的DNA互補的連接寡聚脫氧核苷酸，PLA探針上的DNA就會與該段DNA互補，然后在連接酶的作用下，形成一個閉環(huán)。然后再加入含有熒光標記的核苷酸和聚合酶的擴增緩沖液，通過滾環(huán)擴增（rolling circle amplification，RCA）最終可以在相互作用位點形成數(shù)百個密集的DNA環(huán)，而高濃度的熒光信號在熒光顯微鏡下顯示為一個明亮的斑點，易于檢出[7]。在本研究中，我們將In Situ PLA技術應用于原位驗證MTA1與NuRD復合體其他組分的相互作用，并進一步實施亞細胞定位分析。

1 材料與方法

1.1 細胞

HCT116細胞為ATCC來源，培養(yǎng)條件為DMEM+10%胎牛血清，5%CO2。

圖1 體外IP實驗證實MTA1與HDAC2、Mi2、MBD3的相互作用

1.2 抗體與Duo-link試劑盒

鼠源MTA1一抗購買于Abcam公司；兔源Mi2和MBD3一抗購買于SANTA Cruze；兔源HDAC2一抗購買于Bioworld公司；Duo-link試劑盒購買于Olink Bioscience公司。

1.3 體外co-IP實驗

圖2 原位顯示MTA1與Mi2、HDAC2及MBD3的相互作用

實驗步驟：①收集10 cm大皿的細胞，NP-40裂解液裂解，提取蛋白，采用考馬斯亮藍法進行蛋白定量；②取500μg總蛋白，加入2μg的MTA1一抗，于4℃搖床孵育過夜；③加入20μl proteinA/G beads（Santa Cruze），4℃搖床 2 h；④離心收集beads，NP-40裂解液洗滌6次；⑤使用25 μl蛋白上樣緩沖液煮沸10 min，離心收集上清液；⑥采用Western Blot法鑒定捕獲的蛋白。

1.4 In Situ PLA實驗

按照Duo-link試劑盒說明書操作，大致步驟為：①制備HCT116細胞爬片；②將爬片固定于載玻片上，經(jīng)多聚甲醛固定，Triton-X打孔，BSA封閉后加入鼠源MTA1一抗及另一種待測蛋白的兔源一抗，4℃孵育過夜；③加入試劑盒中帶標記探針的二抗Mouse-PLUS和Rabbit-MINUS，于37℃下孵育1 h；④加入連接反應液，于37℃下反應30 min；⑤加入擴增反應液，于37℃下反應100 min；⑥封片，熒光顯微鏡下檢測紅色斑點狀陽性信號。

2 結果

2.1 IP 技術證明HCT116 細胞中MTA1 與HDAC2、Mi2、MBD3的相互作用

研究報道MTA1是NuRD復合體的一個重要組分[3]，在前期IP-質(zhì)譜實驗中我們也發(fā)現(xiàn)利用MTA1抗體可以捕獲所有已知的NuRD組分，并且通過體外co-IP技術，我們證實HCT116細胞裂解液中MTA1與NuRD組分-HDAC2、Mi2、MBD3具有明顯的相互作用（圖1）。

2.2 In Situ PLA 技術原位顯示MTA1 與HDAC2、Mi2、MBD3在胞內(nèi)的相互作用

體外實驗無法完全模擬復雜的細胞內(nèi)環(huán)境，因此接下來我們首次利用In Situ PLA技術對MTA1與NuRD復合體其他組分HDAC2、Mi2、MBD3的相互作用進行了體內(nèi)原位檢測。如圖2所示，紅色點狀顆粒即表示兩種蛋白具有相互作用，為相互作用陽性信號。結果表明MTA1與Mi2、HDAC2、MBD3均具有明顯的胞內(nèi)相互作用。因為陽性信號數(shù)量的多少可以間接反映相互作用能力強弱，因此我們進一步對50個細胞內(nèi)的陽性信號進行計數(shù)分析，結果表明MTA1-HDAC2組陽性信號數(shù)最多，為363個；MTA1-Mi2組次之，為280個；而MTA1-MBD3組最少，為208個，表明這三者中MTA1-HDAC2相互作用能力最強，MTA1-Mi2次之，MTA1-MBD3最弱。以MTA1-IgG為陰性對照，分別原位檢測MTA1與Mi2、HDAC2及MBD3的相互作用，圖中紅色斑點顆粒即表示一個相互作用反應。箭頭指示該相互作用位于胞質(zhì)

2.3 MTA1/NuRD復合體在間期細胞中的亞細胞定位分析

最初文獻報道MTA1是一個核定位蛋白，因此之前研究均將MTA1/NuRD視為一個核定位的轉(zhuǎn)錄抑制復合體進行功能探索。但是最近大量文獻提示MTA1也分布于胞質(zhì)中，并有可能在胞質(zhì)中發(fā)揮重要功能[8]，因此我們進一步對MTA1/NuRD復合體進行了亞細胞定位分析。結果表明在Mi2、HDAC2及MBD3三個實驗組中分別有25.0%、22.1%及27.0%的胞質(zhì)定位信號，表明MTA1/NuRD復合體在胞質(zhì)中也有分布，其比例約占總數(shù)的 1/4（圖 3）。

圖3 對間期細胞中MTA1與Mi2、HDAC2及MBD3的相互作用信號進行定量分析

2.4 MTA1/NuRD 復合體在M 期細胞中的亞細胞定位分析

根據(jù)陽性信號分布，我們進一步對MTA1/NuRD復合體在有絲分裂期（M期）細胞中的分布進行了定位研究。結果我們首次發(fā)現(xiàn)，雖然在間期MTA1-Mi2主要作用于胞核，但是進入M期后，幾乎全部的陽性信號均分布于凝集的染色體外周（圖4）。MTA1-HDAC2及MTA1-Mi2相互作用的原位分析均得出一致的結果。該結果不僅進一步證實MTA1/NuRD復合體的確存在胞質(zhì)分布，也提示MTA1/NuRD復合體可能參與了細胞周期調(diào)控。通過檢測MTA1-Mi2在HCT116細胞中的相互作用，原位顯示MTA1/NuRD復合體在有絲分裂期的亞細胞定位。圖中紅色斑點顆粒即表示一個相互作用反應。

圖4 MTA1/NuRD復合體在M期細胞中的分布

3 討論

腫瘤轉(zhuǎn)移相關蛋白MTA1在腫瘤發(fā)生發(fā)展尤其是侵襲遷移過程中發(fā)揮至關重要的作用。目前MTA1的功能研究主要集中于胞核轉(zhuǎn)錄因子。然而最近有多篇文章報道MTA1存在胞質(zhì)定位，并且有文章研究指出MTA1在胞質(zhì)中可能參與內(nèi)吞過程[8]。

NuRD復合體是目前發(fā)現(xiàn)的MTA1促進腫瘤發(fā)生發(fā)展的最主要作用機制。但是關于MTA1與NuRD復合體的相互作用現(xiàn)在只有體外的IP-質(zhì)譜證據(jù)，研究者同時指出NuRD復合體中的約70 kD的蛋白有可能是一個與MTA1非常相近的蛋白。在本實驗，我們首次通過In Situ PLA實驗對MTA1與NuRD復合體其他組分之間的相互作用進行了體內(nèi)原位分析，從體內(nèi)水平進一步驗證了MTA1是NuRD復合體的一個組分。

Mi2、HDAC2、MBD3是NuRD復合體中的關鍵因子，其均與染色質(zhì)結構調(diào)控有關。通過陽性信號數(shù)量分析，我們判斷在NuRD復合體中，MTA1與HDAC2的相互作用能力最強，Mi2次之，而MBD3最弱。由于In Situ PLA實驗的作用基礎是兩個蛋白分子有足夠近的距離，因而該結果說明在NuRD復合體中MTA1可能與HDAC2的距離更近，從而有更多的機會發(fā)生寡核苷酸鏈的連接反應，產(chǎn)生陽性信號。

雖然一直以來MTA1/NuRD復合體一直被當作一個核轉(zhuǎn)錄抑制因子，但是至今沒有確鑿的證據(jù)表明MTA1/NuRD復合體只存在于胞核。由于已經(jīng)有多篇文章報道MTA1存在胞質(zhì)定位，提示我們MTA1/NuRD復合體可能也存在胞質(zhì)定位。In Situ PLA技術的一個最大的優(yōu)勢就在于可以準確顯示兩個蛋白之間的作用位點。而通過該技術我們發(fā)現(xiàn)，MTA1/NuRD復合體不僅僅存在于胞核，在胞質(zhì)中也有明顯分布，胞質(zhì)中的分布量約占整個細胞總量的1/4。該結果進一步表明，MTA1有可能既可以通過NuRD復合體在胞核中參與抑制腫瘤抑癌基因的表達，也可以通過NuRD復合體參與胞質(zhì)內(nèi)生物學功能的調(diào)控，如胞質(zhì)蛋白的去乙?；取?/p>

另外，雖然MTA1/NuRD復合體在間期主要存在于胞核（3/4），但是借助于In Situ PLA技術的原位指示優(yōu)勢，我們還首次發(fā)現(xiàn)MTA1/NuRD復合體在M期幾乎全部存在于染色體周圍，表明在M期MTA1/NuRD復合體已經(jīng)與染色質(zhì)解離，無法參與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，但是很可能通過其胞質(zhì)定位參與細胞周期進程調(diào)控。

［1］Toh Y,Pencil SD,Nicolson GL.A novel candidate metastasis-associated gene,mta1,differentially expressed in highly metastatic mammary adenocarcinoma cell lines.cDNA cloning,expression,and protein analyses[J].J Biol Chem,1994,269(37):22958-22963.

［2］Toh Y,Nicolson GL.The role of the MTA family and their encoded proteins in human cancers:molecular functions and clinical implications[J].Clin Exp Metastasis,2009,26(3):215-227.

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［4］Molli PR,Singh RR,Lee SW,et al.MTA1-mediated transcriptional repression of BRCA1 tumor suppressor gene[J].Oncogene,2008,27(14):1971-1980.

［5］Li DQ,Pakala SB,Reddy SD,et al.Revelation of p53-independent function of MTA1 in DNA damage response via modulation of the p21 WAF1-proliferating cell nuclear antigen pathway[J].J Biol Chem,2010,285(13):10044-10052.

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