金槍魚皮膠原蛋白肽分離純化工藝的研究

張 楠 陳海華 冷 云 王雨生，2

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266109）

金槍魚皮膠原粗肽有較高的抗氧化活性，但因粗肽中成分復(fù)雜，含有未酶解的蛋白質(zhì)、分子量不同的肽段、小分子氨基酸、鹽離子等成分，從而影響肽抗氧化活性［1］。因此，有必要分離純化金槍魚皮膠原蛋白粗肽。

膠原肽的傳統(tǒng)精制方法對其抗氧化活性破壞性較強(qiáng)，且活性肽分離純化是制約應(yīng)用與研究的瓶頸技術(shù)［2，3］。目前，超濾法、凝膠柱層析法、離子交換柱層析法、高效液相色譜法等在膠原粗肽分離、純化與鑒定方面已逐漸被人們重視。Sewald等［4］報道了熱水法提取膠原肽會引起自溶、變性和失活，而采用超濾法這一物理方法可有效阻止，更加安全、溫和。Yu等［5］的研究發(fā)現(xiàn)，鹽離子影響肽的分離與活性，離子交換樹脂法根據(jù)肽帶電荷的不同可以較好的脫鹽。江勇［6］研究表明，采用Sephadex C-25型陽離子交換法、Sephadex G-50凝膠過濾法和C18-HPLC分析，能有效分離純化鯊魚皮明膠水解產(chǎn)物，得到具有抗氧化活性的肽。張宇昊等［7］報道，采用超濾、陽離子交換樹脂、高效液相色譜法可精制玉米肽。但是，關(guān)于金槍魚膠原蛋白肽分離純化的方法國內(nèi)外缺乏系統(tǒng)的研究。

分離純化后的膠原肽因其具有較小分子量易被吸收和高效的抗氧化活性而逐漸應(yīng)用于生產(chǎn)［8，9］。目前，中國金槍魚加工水平較低，多以初加工形式輸出給日本，魚皮作為加工的副產(chǎn)物大多被廢棄。若能將金槍魚皮提取出膠原蛋白肽并且分離純化成較純的肽段產(chǎn)品，不僅能開發(fā)新型的具有生物活性的產(chǎn)品，還能提高金槍魚皮的利用效率。本研究擬采用超濾法、凝膠柱層析法、陽離子交換柱層析法、高效液相色譜法等方法，以抗氧化活性為指標(biāo)，對金槍魚皮膠原粗肽進(jìn)行分離純化，旨在為探討水產(chǎn)源膠原肽分離純化工藝提供理論參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

金槍魚皮：－70℃凍存，山東省中魯遠(yuǎn)洋股份有限公司；

中性蛋白酶：2×105U/g，天津諾奧科技發(fā)展有限公司；

Sphadex G-25型凝膠：上海廈美生化科技發(fā)展公司；

Na＋型陽離子交換樹脂：天津巴斯夫化工有限公司；

其它試劑均為分析純。

1.2 儀器

攪拌式超濾裝置：8200型，美國Milipore公司；

高效液相色譜儀：LC-20A型，日本島津公司；

電腦紫外檢測儀：HD-5型，上海青浦滬西儀器廠；

恒流泵：HL-2型，上海青浦滬西儀器廠；

自動部分收集器：BSZ-100型，上海青浦滬西儀器廠；

梯度混合器：TH-1000A型，上海青浦滬西儀器廠；

冷凍干燥機(jī)：FD型，美國西盟國際集團(tuán)金西盟（北京）分公司；

電子天平：BS224S型，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；

pH計：DELTA320型，梅特勒—托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 金槍魚皮膠原粗肽（TSCP）的制備 根據(jù)前期試驗研究，參照文獻(xiàn)［10］，將金槍魚皮用乙醚脫脂、氫氧化鈉去除雜蛋白。將脫雜后金槍魚皮膠原蛋白在60℃加熱15min進(jìn)行預(yù)處理，在pH為7、溫度50℃的條件下，添加1 000U/g金槍魚皮膠原蛋白的中性蛋白酶酶解4h，得到TSCP，經(jīng)濃縮后冷凍干燥，－20℃凍存。

1.3.2 TSCP的超濾制備 參照文獻(xiàn)［11］，采用截留分子量分別為3，5，10kDa的超濾膜對TSCP進(jìn)行超濾分離，收集截留液，測定其DPPH·清除能力、·OH清除能力、O22－清除能力，并收集抗氧化活性較高的截留液，冷凍干燥。

以膜通透量和透過率為指標(biāo)，分別探討超濾壓力、時間、攪拌速度、樣品濃度對TSCP超濾效果的影響，記錄濾過液體積Vφ、膜有效面積S、超濾時間Tφ。金槍魚皮膠原蛋白肽的膜通透量Φ按式（1）計算：

1.3.3 Sphadex G-25葡聚糖凝膠柱層析分離 參照文獻(xiàn)［12］，稱取適量的Sephadex G-25干膠，溶脹、脫氣后裝柱?？寡趸钚暂^強(qiáng)的超濾組分配制成濃度為10mg/mL的溶液，用Sphadex G-25葡聚糖凝膠柱進(jìn)行分離，上樣量1mL，流動相為蒸餾水，流速為0.5mL/min，檢測波長220nm。測定各洗脫組分的DPPH·清除能力、·OH清除能力、O22－清除能力，并收集抗氧化活性較高的洗脫峰，冷凍干燥。

1.3.4 強(qiáng)陽離子交換柱層析分離純化 參照文獻(xiàn)［13］，抗氧化活性較高的凝膠柱層析組分用pH 2.5 20mmol/L檸檬酸—磷酸氫二鈉緩沖液配成40mg/mL的樣品溶液。用緩沖液平衡強(qiáng)陽離子交換柱12h后，上樣后再用緩沖液平衡1 h。待未與樹脂結(jié)合的多肽流出后，分別用不同pH的檸檬酸—磷酸氫二鈉緩沖液進(jìn)行梯度洗脫。流速為1mL/min，檢測波長為220nm。測定各洗脫組分的DPPH·清除能力、·OH清除能力、O22－清除能力，并收集抗氧化活性較高的洗脫峰，冷凍干燥。

1.3.5 高效液相色譜分析測定 參照文獻(xiàn)［14］，用90%乙腈配制濃度為20mg/mL樣品溶液。色譜柱為C－18分析柱；進(jìn)樣量為20μL；流速為0.4mL/min；流動相為90%乙腈（含0.1%三氟乙酸）；紫外檢測器波長230nm。

1.3.6 DPPH·清除能力、·OH清除能力、O22－清除能力及IC50測定 參照文獻(xiàn)［12］、［13］。

2 結(jié)果與分析

2.1 TSCP的超濾分離

由圖1可知：

（1）隨著超濾壓力的增加，濾膜的膜通量呈先升高后降低的趨勢，當(dāng)壓力為0.35MPa時，膜通量最大。這可能是因為當(dāng)增大膜兩側(cè)的壓力差時，小分子量的肽更易通過膜孔隙，使膜通透量升高，但壓力過大，產(chǎn)生了濃差極化現(xiàn)象，會使通透量下降［4］。因此，確定最適超濾壓力為0.35MPa。

（2）隨著超濾時間的延長，膜通量逐漸降低，超過4 0min后，膜通量趨于平緩。這可能是因為隨著時間的延長，超濾膜截留的物質(zhì)越多，堵塞了超濾膜的孔隙，使得膜通量降低［4］。因此，確定最適超濾時間為40min。

（3）隨著攪拌速度的增加，膜通量顯著增加。這說明攪拌操作能夠顯著提高超濾膜效能。因此，確定最適攪拌速度為60r/min。

在最適超濾條件下，TSCP經(jīng)超濾后分別得到組分TSCP-I（分子量＞10kDa）、TSCP-II（分子量5～10kDa）、TSCP-III（分子量3～5kDa）、TSCP-IV（分子量＜3kDa）。

由圖 2 可 知：超 濾 后 的 TSCP-I、TSCP-II、TSCP-III、TSCP-IV的抗氧化活性不同。4種超濾組分相比，分子量越低的組分清除率越高，且TSCP-IV組分對DPPH·自由基、·OH自由基、超氧陰離子的清除率最高，TSCP-I組分基本沒有抗氧化活性。

由圖3可知：與TSCP相比，TSCP-IV的3種自由基清除率的IC50均顯著降低，分別為0.17，0.20，1.64mg/mL。這說明分子量小于3kDa的TSCP-IV組分對DPPH·自由基、·OH自由基、超氧陰離子均有較好的清除效果，與原粗肽TSCP相比，抗氧活性顯著加強(qiáng)。本研究結(jié)果與他人［14－15］的結(jié)果相似。郭瑤［14］的研究表明，羅非魚皮酶解液小于1kDa的組分抗氧化活性較好。與其它植物蛋白相比，TSCP-IV的抗氧化效果較好。周玲玲等［15］報道，玉米花生復(fù)合蛋白肽分子量小于3kDa的組分的DPPH·自由基、·OH自由基、超氧陰離子清除率的IC50分別為3.91，3.22，1 2.41mg/mL。因此，選取TSCP-IV進(jìn)行下一步的分離純化。

2.2 Sphadex G-25葡聚糖凝膠柱層析分離

由圖4可知，TSCP-IV經(jīng)過凝膠柱過濾層析后，分離為分子量大小不同的4個峰，分別為 GP-I、GP-II、GP-III、GPIV，其中 GP-I、GP-II、GP-III表現(xiàn)出不同的抗氧化活性。表現(xiàn)出抗氧化活性的3個峰相比，GP-I對DPPH·自由基、·OH自由基、超氧陰離子的清除率較高。

圖1 超濾壓力、時間、攪拌速度對TSCP溶液膜通量的影響Figure 1 Effect of pressure，time，rate of agitation on the ultra-filtration permeation flux

圖2 TSCP超濾后各組分的自由基清除率Figure 2 Free radical scavenging of each fractions isolated by ultrafiltration from TSCP

圖3 TSCP與TSCP-IV清除自由基能力的半數(shù)抑制濃度IC50Figure 3 IC50of scavenging ability of TSCP and TSCP-IV

圖4 TSCP-IV凝膠柱層析圖譜圖及各峰對自由基清除率的影響Figure 4 Elution profile of TSCP-IV by gel column chromatography and effect of each peaks on scavenging

由圖5可知，與TSCP-IV相比，GP-I的3種自由基清除率的IC50均顯著降低，分別為50.01，86.56，6 23.75μg/mL。這說明TSCP-IV組分中分子量較大的GP-I對DPPH·自由基、·OH自由基、超氧陰離子均有較好的清除效果，且與原粗肽TSCP相比，抗氧活性顯著加強(qiáng)。與其它研究結(jié)果相比，本研究GP-I組分的抗氧化效果較好?？聠毯绲龋?6］研究表明，金槍魚頭凝膠過濾組分·OH自由基清除率的IC50為527μg/mL。因此，選取GP-I組分進(jìn)行下一步的分離純化。

2.3 強(qiáng)陽離子交換柱層析

圖5 TSCP-IV與GP-I的半數(shù)抑制濃度IC50Figure 5 IC50of TSCP-IV and GP-I

圖6 GP-I的離子交換柱層析圖譜圖及各峰對自由基清除率的影響Figure 6 Elution profile of peak one by steped ion exchange chromatography and effect of each peaks on scavenging

由圖6可知：經(jīng)離子交換柱層析后，GP-I可分離為IP-I（pH 2.5時的柱前峰）、IP-II（pH 5.6時的洗脫峰）、IP-III（pH 7.1時的洗脫峰）和IP-IV（pH 8.2時的洗脫峰）。IP-I、IP-II表現(xiàn)出不同的抗氧化活性，IP-III、IP-IV 基本沒有抗氧化活性。與IP-I相比，IP-II對DPPH·自由基、·OH自由基、超氧陰離子的清除率較高。

由圖7可知：與GP-I組分相比，IP-II對3種自由基清除率的IC50均顯著降低，分別為21.59，20.28，1 21.23μg/mL。這說明IP-II對DPPH·自由基、·OH自由基、超氧陰離子均有較好的清除效果，與原粗肽相比，抗氧活性顯著加強(qiáng)。因此，選取離子交換層析的IP-II進(jìn)行下一步的純度鑒定。

圖7 GP-I與IP-II的半數(shù)抑制濃度IC50Figure 7 IC50of GP-I and IP-II

2.4 高效液相色譜分析

圖8 高效液相色譜圖Figure 8 HPLC chromatography

圖8（b）中后出的峰保留時間、出峰時間和峰面積與圖8（a）相同，即為90%乙腈的溶劑峰，因此，圖8（b）中先出的峰為樣品峰。這說明經(jīng)過超濾、凝膠過濾、離子交換分離純化后的IP-II為純度較高的肽段，具有較好的抗氧化活性。本研究結(jié)果與其他學(xué)者的研究相比，分離純化效果較好。Jae-Young等［17］報道，酶解狹鱈魚肽經(jīng)過陰陽離子、凝膠過濾純化得到分子量相對集中的4個峰，其中，抗氧化活性較高的峰經(jīng)兩次高效液相分離純化后得到了單一的樣品峰。董玉蓮的研究［18］表明，酶解雜魚肽瓊脂糖樹脂分離后，經(jīng)反相高效液相色譜分離出4個峰。郭瑤的研究［14］表明，酶解羅非魚皮膠原肽經(jīng)超濾、凝膠過濾分離后的高效液相色譜分析圖譜得到3個峰，且只有一個峰組分具有抗氧化活性。陳軒［19］研究發(fā)現(xiàn)，具有抗氧化活性的酶解鰱魚蛋白肽經(jīng)離子交換樹脂純化后的高效液相色譜圖呈現(xiàn)2個峰面積較大的峰形。

3 結(jié)論

在TSCP超濾的最佳工藝條件下進(jìn)行超濾，得到組分TSCP-I（分子量＞10kDa）、TSCP-II（分子量5～10kDa）、TSCP-III（分子量3～5kDa）、TSCP-IV（分子量＜3kDa）。對4個組分的能力進(jìn)行測定，分子量越低的組分DPPH·自由基、·OH自由基、超氧陰離子清除率越高，且分子量小于3kDa的TSCP-IV組分的清除率最高，IC50值分別為0.17，0.20，1.64mg/mL。對 TSCP-IV 進(jìn)行Sephadex G-25凝膠柱過濾層析后，峰GP-I的得率較高，且峰GP-I對DPPH·自由基、·OH自由基、超氧陰離子的清除率較高，IC50值分別為50.01，86.56，623.75μg/mL。將凝膠過濾組分 GP-I經(jīng)離子交換柱用不同pH值溶液梯度洗脫后，pH 5.61時的洗脫峰IP-II的得率較高，且IP-II對DPPH·自由基、·OH自由基、超氧陰離子清除率較高，IC50值分別為21.59，2 0.28，121.23μg/mL。用高效液相色譜分析表明，IP-II為純度較高的金槍魚皮膠原抗氧化肽段。

1 Woo J W，Yu S J，Cho S M，et al.Extraction optimization and properties of collagen from yellowfin tuna（Thunnus albacares）dorsal skin［J］.Food Hydrocolloids，2008（22）：879～887.

2 申鋒.草魚魚鱗膠原肽的制備及其特性研究［D］.武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

3 Jao C L，Huang S L，Hsu K C.Angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides：Inhibition mode，bioavailability，and antihypertensive effects［J］.BioMedicine，2012，2（4）：130～136.

4 Sewald N，Jakubke H D.Peptides：chemistry and biology［M］.Weinheim，Germany：Wiley-Vch.Verlag GmbH.，2002：562.

5 Yu Y，Hu J，Miyaguchi Y，et al.Isolation and characterization of angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides derived from porcine hemoglobin［J］.Peptides，2006，27（11）：2 950～2 956.

6 江勇，汪少蕓，饒平凡.鯊魚皮明膠水解肽的制備、分離純化與抗氧化活性研究［J］.中國食品學(xué)報，2012，12（3）：28～33.

7 張宇昊.花生短肽制備及其功能活性研究［D］.北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2007.

8 Xie Z J，Huang J R，Xu X M.Antioxidant activity of peptides isolated from alfalfa leaf protein［J］.Food Chemistry，2008（111）：370～376.

9 K uo-Chiang H，Geng-Hwang L，Chia-Ling J.Antioxidative properties of peptides prepared from tuna cooking juice hydrolysates with orientase（Bacillus subtilis）［J］.Food Research International，2009（42）：647～652.

10 冷云，王慧云，陳海華.制備金槍魚皮膠原蛋白肽的預(yù)處理工藝研究［J］.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2013，30（3）：3 3～37.

11 Li Z Y，Youravong W，H-Kittikun A.Purification of protease from pre-treated tuna spleen extract by ultrafiltration：An altered operational mode involving critical flux condition and diafiltration［J］.Separation and Purification Technology，2009，66（2）：368～374.

12 Je J Y，Qian Z J，Byun H G，et al.Purification and characterization of an antioxidant peptide obtained from tuna backbone protein by enzymatic hydrolysis［J］.Process Biochemistry，2007（42）：840～846.

13 Wu H C，Chen H M，Shiau C Y.Free amino acids and peptides as related to antioxidant properties in protein hydrolysates of mackerel（Scomber austriasicus）［J］.Food Research International，2003，36（9～10）：949～957.

14 郭瑤.羅非魚皮膠原肽的制備及其抗氧化活性的研究［D］.青島：中國海洋大學(xué)，2006.

15 周玲玲.玉米花生復(fù)合蛋白酶解產(chǎn)物生物活性及加工性能的研究［D］.武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

16 柯喬虹.酶解金槍魚頭蛋白制備抗氧化活性肽的研究［D］.廣東：廣東海洋大學(xué)，2011.

17 Jae-Young J，Pyo-Jam P，Se-Kwon K.Antioxidant activity of a peptide isolated from Alaska ollack（Theragrachalcogramma）frame protein hydrolysate［J］.Food Research International，2005（38）：45～50.

18 董玉蓮.一種海產(chǎn)小雜魚酶解物生理活性組分的分離純化與表征［D］.北京：中國科學(xué)院，2002.

19 陳軒.鰱魚抗氧化肽的制備、精制工藝及其功能特性研究［D］.武漢：武漢工業(yè)學(xué)院，2012.