麻瘋樹籽殼總黃酮的提取及其羥基自由基清除作用

馬 博 張婷婷 黎遠(yuǎn)成 仝海娟

（百色學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系，廣西 百色 533000）

麻瘋樹（JatrophacurcasL.）為大戟科麻瘋樹屬多年生灌木或小喬木植物，別名膏桐、小桐子等。因其種子油脂組成與其它植物油脂相似，且含油量高而成為一種重要的生物能源樹種，加上麻瘋樹抗逆性強(qiáng)，廣泛分布于熱帶、亞熱帶地區(qū)，成為一種備受青睞的非糧木本油料作物［1］。據(jù)報(bào)道［2，3］，到2015年全球麻瘋樹種植面積將達(dá)1 280萬(wàn)hm2，中國(guó)將達(dá)800萬(wàn)hm2，那么屆時(shí)將生產(chǎn)大量的麻瘋樹種子。此外，麻瘋樹在民間可全株入藥［4，5］。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已從麻瘋樹的根莖葉等部位分離得到包括黃酮類在內(nèi)的多種生物活性物質(zhì)。其中，已報(bào)道的麻瘋樹葉中黃酮類物質(zhì)有牡荊素、異牡荊素、芹素、5，4′-二羥-6，7葡萄糖苷黃酮及5－羥-3，7，4′-鼠李糖苷黃酮；根中黃酮類物質(zhì)有5－羥基吡咯-2-酮，嘧啶-2，4-酮及川皮苷；莖皮中黃酮類物質(zhì)有5，4′-二甲羥基-3，7，3′-三甲氧基黃酮，5，3′，4′-三羥基-3，7-二甲氧基黃酮及槲皮素-3-甲醚；籽粕中黃酮類物質(zhì)有嘧啶-2，4-酮，3′-甲氧基黃酮及胡蘿卜苷［6－8］。此外，范樹國(guó)等［9］用3種不同方法測(cè)定了麻瘋樹中的總黃酮含量，并比較了根莖葉的黃酮含量；Zhang等［10］利用響應(yīng)面法優(yōu)化了麻瘋樹葉中總黃酮的提取工藝，并對(duì)其抗菌活性進(jìn)行了研究。麻瘋樹籽殼為其種子硬化的外種皮，當(dāng)前有關(guān)其黃酮的研究還未見(jiàn)有報(bào)道。本研究擬針對(duì)麻瘋樹籽殼中的總黃酮，通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化其提取條件，并研究其提取物（JCF）的羥基自由基（·OH）清除能力，旨在為今后麻瘋樹籽殼的資源化利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

麻瘋樹籽：FD-8號(hào)，廣西南寧富民達(dá)生物能源科技有限公司；

2，6-二 叔 丁 基-4-甲 基 苯 酚 （butylated hydroxytoluene，BHT）：色譜純（＞99.0%），阿拉丁化學(xué)試劑有限公司；

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：純度＞98.0%，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

抗壞血酸（Vc）：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

鄰菲啰啉和硫酸亞鐵：分析純，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；

硝酸鋁：分析純，廣東光華科技股份有限公司；

亞硝酸鈉：分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠；

無(wú)水乙醇：分析純，西隴化工公分有限公司；

石油醚（30～60℃）：分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：UV-2700型，日本島津公司；

電子分析天平：FA2004型，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；

高速冷凍離心機(jī)：TGL-16M型，湘儀離心機(jī)儀器有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE-52型，上海亞榮生化儀器廠；

真空泵：SHB-Ⅲ型，鄭州世紀(jì)雙科實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH-S2型，金壇市醫(yī)療儀器廠；

鼓風(fēng)干燥箱：DHG-9146A型，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；

中藥粉碎機(jī)：LD-200型，長(zhǎng)沙常宏制藥機(jī)械設(shè)備廠。

1.2 方法

1.2.1 樣品預(yù)處理 種子去雜除塵后脫仁，籽殼置于電熱鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)50℃干燥72h，粉碎、過(guò)60目篩，石油醚索氏回流脫脂12h、揮干石油醚，將其4℃保藏、備用。

1.2.2 總黃酮提取 取適量麻瘋樹籽殼粉末，置于圓底燒瓶中，在一定溫度下用不同濃度和體積的乙醇溶液回流提取一段時(shí)間后，抽濾、定容。

1.2.3 總黃酮含量測(cè)定 采用亞硝酸鈉—硝酸鋁—?dú)溲趸c顯色法［11］。修改如下：分別精密量取0.2mg/mL蘆丁溶液（30%乙醇制）0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0mL，置入25mL容量瓶中，各加1.0mL 5%的NaNO2溶液，混勻后靜置6min；再各加1.0mL 10%的 Al（NO3）3溶液，混勻，靜置6min；最后各加10mL 4%的NaOH溶液，混勻，30%乙醇溶液定容，靜置15min。以空白試劑為對(duì)照，在510nm處測(cè)定各自吸光度，再以吸光度為縱坐標(biāo)、以蘆丁的不同質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得回歸方程為Y＝0.439 7x－0.000 5，R2＝0.999 8，線性范圍為0.2～1.0mg/mL。

1.2.4 總黃酮得率計(jì)算 取1.0mL麻瘋樹籽殼總黃酮提取液，置入25mL容量瓶中，按照1.2.3方法測(cè)定總黃酮提取液的吸光度，并代入回歸方程，求出麻瘋樹籽殼提取液中總黃酮的質(zhì)量濃度。代入式（1）計(jì)算麻瘋樹籽殼中總黃酮的含量。

式中：

R——總黃酮得率，%；

c——提取液中黃酮濃度，mg/mL；

v——黃酮提取液體積，mL；

n——稀釋倍數(shù)；

m——麻瘋樹籽殼質(zhì)量，g。

1.2.5 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

（1）乙醇濃度對(duì)麻瘋樹籽殼總黃酮得率的影響：在料液比1∶30（m∶V），乙醇濃度40%，50%，60%，70%，80%，7 0℃回流提取2.0h的條件下，考察提取溶劑乙醇濃度對(duì)麻瘋樹籽殼總黃酮得率的影響。

（2）提取時(shí)間對(duì)麻瘋樹籽殼總黃酮得率的影響：在料液比1∶30（m∶V），乙醇濃度60%，70℃回流提取0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0h的條件下，考察提取時(shí)間對(duì)麻瘋樹籽殼總黃酮得率的影響。

（3）料液比對(duì)麻瘋樹籽殼總黃酮得率的影響：在料液比1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50（m∶V），乙醇濃度60%，7 0℃回流提取時(shí)間2.5h的條件下，考察料液比對(duì)麻瘋樹籽殼總黃酮得率的影響。

（4）提取溫度對(duì)麻瘋樹籽殼總黃酮得率的影響：在料液比1∶30（m∶V），乙醇濃度60%，分別于40，50，60，70，80，85，90，95℃回流提取2.5h的條件下，考察提取溫度對(duì)麻瘋樹籽殼總黃酮得率的影響。

1.2.6 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，確定正交試驗(yàn)所用因素的3個(gè)水平，按照L9（34）正交試驗(yàn)表進(jìn)行設(shè)計(jì)，每個(gè)條件組合平行3次試驗(yàn)。

1.2.7 羥基自由基（·OH）清除試驗(yàn) 采用鄰二氮菲—Fe2＋＋H2O2氧化法［12］。0.75mmol/L的鄰二氮菲 溶液1.0mL，加入0.2mol/L的PBS 2.0mL和不同質(zhì)量濃度的麻瘋樹籽殼總黃酮溶液1.0mL，混勻，加入0.75mmol/L的F eSO4溶液1.0mL，立即混勻。再加入0.01%（V/V）H2O2溶液1.0mL啟動(dòng)反應(yīng)，37℃恒溫水浴1.0h后，于536nm處測(cè)定吸光度，記錄為A樣，用1.0mL蒸餾水代替不同質(zhì)量濃度麻瘋樹籽殼總黃酮溶液，其余步驟同上，測(cè)得吸光度記錄為A損，用2.0mL蒸餾水分別代替H2O2和不同質(zhì)量濃度麻瘋樹籽殼總黃酮溶液，其余步驟同上，測(cè)得吸光度記錄為A未，平行3次。按式（2）計(jì)算·OH清除率（η1）：

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇濃度對(duì)麻瘋樹籽殼總黃酮得率的影響 隨著乙醇濃度增加，溶劑滲透力增強(qiáng)，弱極性黃酮得率也隨之增加；當(dāng)乙醇達(dá)到一定濃度后，弱極性黃酮溶出達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，而極性黃酮得率卻不斷減少，加上色素、鞣質(zhì)等脂溶性雜質(zhì)與弱極性黃酮競(jìng)爭(zhēng)溶劑，致使其向主體溶劑擴(kuò)散速度減慢，致使黃酮總得率降低。由圖1可知，乙醇濃度為60%時(shí)，黃酮提取得率達(dá)到最大，故選擇乙醇濃度60%作為后續(xù)單因素試驗(yàn)條件。

圖1 乙醇濃度對(duì)麻瘋樹籽殼總黃酮得率的影響Figure 1 Effect of alcohol concentration on the total flavonoids yield of Jatropha curcus L.seed shell

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)麻瘋樹籽殼總黃酮得率的影響 黃酮提取是一個(gè)傳質(zhì)過(guò)程，平衡需要一定時(shí)間。如果時(shí)間過(guò)短，傳質(zhì)平衡未達(dá)到，黃酮提取得率就偏低；當(dāng)傳質(zhì)過(guò)程基本平衡后，再延長(zhǎng)提取時(shí)間，黃酮得率也不會(huì)有顯著增加，而熱穩(wěn)定性較差的黃酮卻一直在降解。由圖2可知，隨著提取時(shí)間的增加，黃酮得率也不斷上升；但超過(guò)2.5h后，麻瘋樹籽殼總黃酮的得率有所下降，故選擇提取時(shí)間2.5h作為后續(xù)單因素試驗(yàn)條件。

圖2 提取時(shí)間對(duì)麻瘋樹籽殼總黃酮得率的影響Figure 2 Effect of extraction time on the total flavonoids yield of Jatropha curcus L.seed shell

2.1.3 料液比對(duì)麻瘋樹籽殼總黃酮得率的影響 由圖3可知，隨著料液比的增加，黃酮提取得率不斷增加，達(dá)到1∶30（m∶V）后，黃酮得率增加不明顯。這是因?yàn)榱弦罕仍黾?，物料與溶劑之間黃酮濃度差增大，傳質(zhì)阻力變小，有利于黃酮的溶出；但料液比達(dá)到一定比例后，黃酮基本溶出，再增加料液比，黃酮得率變化不大，且物耗和能耗增加，不利于黃酮后續(xù)精制。故選擇料液比1∶30（m∶V）作為后續(xù)單因素試驗(yàn)條件。

圖3 料液比對(duì)麻瘋樹籽殼總黃酮得率的影響Figure 3 Effect of ratio of solid to liquid on the total flavonoids yield of Jatropha curcus L.seed shell

2.1.4 提取溫度對(duì)麻瘋樹籽殼總黃酮得率的影響 溫度升高，分子運(yùn)動(dòng)加劇、溶劑黏度降低、傳質(zhì)過(guò)程加快，有利于溶質(zhì)擴(kuò)散和溶劑滲透，進(jìn)而有助于麻瘋樹籽殼總黃酮的提取。由圖4可知，麻瘋樹籽殼總黃酮提取得率隨著提取溫度上升而增加，90℃時(shí)達(dá)到最大，為6.576%。試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，60%乙醇在85～90℃時(shí)核狀沸騰，95℃時(shí)膜狀沸騰，溶劑損失大、雜質(zhì)溶出較多，不利于黃酮溶出，黃酮得率減少。故選取85℃作為后續(xù)試驗(yàn)優(yōu)化的條件。

圖4 提取溫度對(duì)麻瘋樹籽殼總黃酮得率的影響Figure 4 Effect of extraction temperature on the total flavonoids yield of Jatropha curcus L.seed shell

2.1.5 提取次數(shù)對(duì)麻瘋樹籽殼總黃酮得率的影響 由圖5可知，第1次黃酮提取得率為6.379%，占3次黃酮提取得率之和的89.5%。考慮到試驗(yàn)可行性，以及減小試驗(yàn)誤差，故確定后續(xù)正交試驗(yàn)提取1次。

2.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果與分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定了乙醇濃度、提取時(shí)間、料液比及提取溫度4個(gè)因素的水平（表1），進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

圖5 提取次數(shù)對(duì)麻瘋樹籽殼總黃酮得率的影響Figure 5 Effect of extraction times on the total flavonoids yield of Jatropha curcus L.seed shell

表1 正交試驗(yàn)因素水平Table 1 Levels of orthogonal test factors

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results of orthogonal test

由正交試驗(yàn)結(jié)果的極差R可以看出，麻瘋樹籽殼的總黃酮提取得率影響因素大小依次為提取溫度、料液比、提取時(shí)間和乙醇濃度。最佳的因素組合為A1B3C3D2，即乙醇濃度50%、提取時(shí)間3.0h，料液比1∶40（m∶V），提取溫度85℃。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

在最佳的提取因素組合（A1B3C3D2）條件下，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，麻瘋樹籽殼的總黃酮平均得率為6.61%，RSD為1.9%，大于L9（34）正交試驗(yàn)表所有因素組合的試驗(yàn)結(jié)果，表明本試驗(yàn)優(yōu)化的提取條件較為可靠，重現(xiàn)性好，達(dá)到了優(yōu)化的目的。

2.4 羥基自由基清除作用

·OH作為一種得電子極強(qiáng)的活性氧，能夠使脂質(zhì)過(guò)氧化、核酸斷裂及其它生物大分子降解等，對(duì)生物機(jī)體危害極大。麻瘋樹籽殼總黃酮的·OH清除作用見(jiàn)圖6。在測(cè)定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，麻瘋樹籽殼提取物與對(duì)照Vc和BHT的·OH清除能力均隨著質(zhì)量濃度的上升而增強(qiáng)，且存在劑量依賴關(guān)系；但在相同質(zhì)量濃度下，麻瘋樹籽殼乙醇提取物的·OH清除率均比Vc和BHT大，其黃酮半數(shù)抑制濃度（IC50）為0.130mg/mL，分別大于 Vc和BHT的0.164mg/mL和0.462mg/mL。當(dāng)麻瘋樹籽殼提取物中的黃酮質(zhì)量濃度為0.3 mg/mL時(shí)，其·OH清除率達(dá)89.95%，說(shuō)明麻瘋樹籽殼提取物具有很強(qiáng)的·OH清除能力。

圖6 麻瘋樹籽殼乙醇提取物對(duì)羥基自由基的清除作用Figure 6 Scavenging activity of ethanol extract from Jatropha curcus L.seed shell on hydroyxl radicals

3 結(jié)論

本試驗(yàn)利用回流法優(yōu)化了麻瘋樹籽殼中的總黃酮提取工藝，提取因素乙醇濃度、提取時(shí)間、料液比及提取溫度對(duì)麻瘋樹籽殼總黃酮得率的影響依次增大，最佳提取工藝組合為乙醇濃度50%、提取時(shí)間3.0h，料液比1∶40（m∶V），提取溫度85℃；在此條件下總黃酮提取平均得率為6.61%，高于文獻(xiàn)［9］報(bào)道的麻瘋樹根、莖、葉的3.055 0%，0.422 0%，4.874 5%。另外，麻瘋樹籽殼黃酮提取物具有較強(qiáng)的·OH清除力，其IC50為0.130mg/mL，分別高于抗氧化劑Vc和BHT。鑒于以上結(jié)果，麻瘋樹籽殼可以作為天然抗氧劑的生產(chǎn)原料。但今后還有必要對(duì)麻瘋樹籽殼中的黃酮進(jìn)行分離純化與結(jié)構(gòu)表征，通過(guò)體內(nèi)與體外方法更為全面評(píng)價(jià)其抗氧化性能，以便更深入的了解麻瘋樹籽殼黃酮與其抗氧化性能之間的構(gòu)效關(guān)系。

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