中藥“連蒲”透皮劑的穩(wěn)定性、刺激性和安全性試驗(yàn)

路孝兵，聶 奎，肖 蓉，李 嬌，莫 瓊，鄭業(yè)龍

（西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，重慶 北碚 400715）

中藥“連蒲”乳房炎搽劑是以中草藥連翹和蒲公英為主藥，以50%乙醇為溶劑，并添加以氮酮、丙二醇和薄荷醇為復(fù)合透皮促進(jìn)劑制成的含高分子有機(jī)化合物的供揉搽無(wú)破損皮膚表面用的液體制劑。將之涂搽于奶牛乳房皮膚，溶劑部分會(huì)迅速揮發(fā)，其余部分則形成一層薄膜，膜內(nèi)藥物成分在透皮促進(jìn)劑的作用下緩慢被乳房皮膚吸收，從而起到治療奶牛乳房炎的作用。由于該制劑直接作用于皮膚，而且添加有氮酮、丙二醇和薄荷醇等化學(xué)物質(zhì)，因此，該制劑是否穩(wěn)定，涂搽皮膚后對(duì)皮膚是否有刺激性，吸收后是否會(huì)引起急性毒性反應(yīng)，都有必要進(jìn)行研究。本試驗(yàn)首先對(duì)“連蒲”乳房炎搽劑的穩(wěn)定性進(jìn)行考察，同時(shí)以成年健康家兔為試驗(yàn)動(dòng)物，考察“連蒲”乳房炎搽劑單次和多次給藥分別對(duì)完整和受損皮膚的刺激性以及不同給藥劑量的急性毒性。

1 試驗(yàn)材料

1.1 試驗(yàn)藥物 自制中藥乳房炎搽劑“連蒲”，處方由中藥連翹和蒲公英組成，含生藥量1g/mL，其中添加有3%的氮酮、6%的1，2-丙二醇和4%的薄荷醇作為透皮促進(jìn)劑，該搽劑系外用透皮吸收藥，可在擠奶前按摩乳房時(shí)涂抹在乳房上，通過(guò)按摩加快藥物透皮吸收。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 成年健康家兔共18只，雌雄各半，體重在 1.5±0.2kg。

1.3 主要試劑 普通培養(yǎng)基平板，自制；無(wú)水乙醇（分析純，批號(hào)：20090411），硫化鈉（分析純，批號(hào)：20090827），均購(gòu)自成都市科龍化工試劑廠。

1.4 主要器材 電熱壓力蒸汽滅菌鍋，電熱恒溫培養(yǎng)箱，超凈工作臺(tái)，冰箱，PHS-25C酸度計(jì)，砂紙，毛剪，一次性注射器，紗布等。

2 試驗(yàn)方法

2.1 穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.1.1 考察項(xiàng)目及方法。外觀：“連蒲”搽劑應(yīng)為棕黑色、有芳香氣味、分散均勻的液狀溶液；pH值：應(yīng)為6.5～7.5，可用常規(guī)酸度計(jì)測(cè)定；HPLC法鑒別：應(yīng)檢出連翹苷，參照《中國(guó)藥典》2005年版二部中連翹苷的檢測(cè)方法測(cè)定，含量（標(biāo)示量，%）為每1mL搽劑含連翹苷應(yīng)不少于20mg；微生物限度檢查：搽劑檢出細(xì)菌、霉菌和酵母菌數(shù)均應(yīng)小于100個(gè)/mL，銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌不得檢出。

2.1.2 常溫留樣考察。取玻璃瓶包裝的乳房炎搽劑“連蒲”樣品3瓶置于25℃環(huán)境，分別在1、2、3個(gè)月后取樣測(cè)定。

2.1.3 加速試驗(yàn)考察。取玻璃瓶包裝的乳房炎搽劑“連蒲”樣品6瓶分別于40℃、75%相對(duì)濕度（RH）和4℃冰箱中放置，定期在1、2、3個(gè)月后取樣測(cè)定。

2.2 皮膚刺激性試驗(yàn)

2.2.1 試驗(yàn)動(dòng)物的處理與分組。取體重相近的白色家兔8只，隨機(jī)分為4組，每組2只。分為完整皮膚組I、II和破損皮膚組III、IV。將家兔背部?jī)蓚?cè)毛剪短后，用5%Na2S脫毛約50cm2左右，選脫毛24h后無(wú)破損皮膚的家兔作為I、II組試驗(yàn)兔；III、IV組家兔在消毒皮膚后，用砂紙摩擦皮膚，以滲血為度，作為破損皮膚試驗(yàn)區(qū)。

2.2.2 單次給藥的皮膚刺激性試驗(yàn)。脫毛及破損皮膚后第2d，分別在第I組和第III組家兔左側(cè)脫毛區(qū)涂藥，每次涂搽2.0mL，采用自身左右對(duì)照同時(shí)在右側(cè)脫毛區(qū)涂2.0mL未添加透皮促進(jìn)劑的藥物作為陰性對(duì)照，蓋上一層紗布，用無(wú)刺激性膠布固定。每只動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，涂藥后24h用無(wú)菌溫水清洗殘留藥物，清洗后分別在 l、24、48、72h時(shí)肉眼觀察并記錄涂藥部位有無(wú)紅斑和水腫等情況。

2.2.3 多次給藥的皮膚刺激性試驗(yàn)。分別在第II組和第IV組家兔左側(cè)脫毛區(qū)涂藥，右側(cè)涂未添加透皮促進(jìn)劑的藥物，每天涂藥2次，每次2.0mL，涂藥后用滅菌紗布固定，連續(xù)用藥7d。在末次用藥4h后取下紗布，用無(wú)菌溫水洗去殘留藥物，觀察并記錄涂抹部位有無(wú)紅斑和水腫等情況。

2.2.4 刺激強(qiáng)度的判定。對(duì)涂抹部位有無(wú)紅斑和水腫等情況進(jìn)行評(píng)分（見(jiàn)表1），根據(jù)下列公式計(jì)算平均積分值，并進(jìn)行刺激強(qiáng)度評(píng)價(jià)（見(jiàn)表2）。多次給藥的皮膚刺激性試驗(yàn)，還需觀察涂抹部位是否有色素沉著、出血點(diǎn)、皮膚粗糙或皮膚菲薄等情況，并觀察試驗(yàn)兔的活動(dòng)、飲食、精神狀態(tài)等。連續(xù)觀察一周。

公式：每組動(dòng)物平均積分=Σ（紅斑積分+水腫積分）/受試動(dòng)物數(shù)

2.3 安全性試驗(yàn)

2.3.1 試驗(yàn)動(dòng)物的分組與處理。取體重相近的白色家兔10只，隨機(jī)分成5組，每組2只。分別是低劑量完整皮膚組I、高劑量完整皮膚組II、低劑量破損皮膚組III、高劑量破損皮膚組IV和對(duì)照組V。于給藥前24h，將家兔背部?jī)蓚?cè)毛剪短后，用5%Na2S脫毛約50cm2左右。III、IV組家兔在消毒皮膚后，用砂紙摩擦皮膚，以滲血為度，作為破損皮膚試驗(yàn)區(qū)。

表1 皮膚刺激性反應(yīng)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

表2 皮膚刺激性強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

2.3.2 不同給藥劑量的皮膚急性毒性試驗(yàn)。脫毛及破損皮膚后第2d，分別在家兔脫毛區(qū)涂藥，第I組和第III組每次涂抹2.0mL，第II、IV組每次涂抹5.0mL，涂藥后蓋上一層紗布，用無(wú)刺激性膠布固定。每只動(dòng)物分籠飼養(yǎng)。涂藥24h后，用溫水或無(wú)刺激溶劑除去殘留的受試藥物，去除受試藥物后1、24、48、72h至第7d，每日觀察并記錄動(dòng)物的體溫、皮膚、毛發(fā)、眼和黏膜的變化，以及呼吸系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、四肢活動(dòng)等有無(wú)中毒表現(xiàn)。若有死亡動(dòng)物，應(yīng)及時(shí)進(jìn)行尸檢和肉眼觀察，當(dāng)有肉眼可見(jiàn)病變時(shí)，應(yīng)進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 “連蒲”的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果 中藥“連蒲”乳房炎搽劑的常溫留樣和加速試驗(yàn)表明，該制劑在常溫（25℃）、高溫（40℃）、低溫（4℃）下放置3個(gè)月后，制劑的外觀性狀、pH值、連翹苷含量等檢查結(jié)果與制備初期相比均無(wú)明顯變化，且微生物限度檢查合格。

3.2 “連蒲”的刺激性試驗(yàn)結(jié)果 皮膚刺激性試驗(yàn)結(jié)果顯示：I、II組（完整皮膚組）家兔皮膚均未出現(xiàn)紅斑和水腫現(xiàn)象，記0分；III、IV組（破損皮膚組）家兔皮膚均未出現(xiàn)水腫，第III組家兔皮膚未出現(xiàn)紅斑現(xiàn)象，第IV組有1只家兔皮膚出現(xiàn)輕微紅斑現(xiàn)象，但12h內(nèi)很快消退，記1分，組內(nèi)平均積分為（0+0+1+0）/2=0.5，見(jiàn)表3。參照皮膚刺激性反應(yīng)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)和皮膚刺激性強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，得出中藥“連蒲”乳房炎搽劑對(duì)皮膚無(wú)刺激性。

3.3 “連蒲”的安全性試驗(yàn)結(jié)果 不同給藥劑量的皮膚急性毒性試驗(yàn)結(jié)果顯示：各組家兔的采食、體溫、皮膚、毛發(fā)、眼、黏膜、呼吸、中樞神經(jīng)系統(tǒng)及四肢活動(dòng)等狀況均正常，未見(jiàn)中毒或異常癥狀，更未出現(xiàn)死亡情況，說(shuō)明中藥“連蒲”乳房炎搽劑無(wú)急性皮膚毒性，安全性良好。

表3 “連蒲”對(duì)家兔皮膚的刺激性評(píng)分

4 結(jié)論與分析

4.1 結(jié)論 本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)中藥“連蒲”乳房炎搽劑的外觀、pH值、連翹苷含量、微生物限度檢查、常溫留樣和加速試驗(yàn)觀察等項(xiàng)目的穩(wěn)定性進(jìn)行考察；以成年健康家兔為試驗(yàn)動(dòng)物，考察“連蒲”乳房炎搽劑單次和多次給藥分別對(duì)完整和受損皮膚的刺激性，以及不同給藥劑量的急性毒性。常溫留樣和加速試驗(yàn)顯示，該制劑在常溫（25℃）、高溫（40℃）、低溫（4℃）下放置3個(gè)月后，其外觀性狀、pH值、連翹苷的含量等檢查結(jié)果與制備初期相比均無(wú)明顯變化，且微生物限度檢查合格。皮膚刺激性試驗(yàn)表明，單次給藥和多次給藥后皮膚均未出現(xiàn)紅斑和水腫；不同給藥劑量的皮膚急性毒性試驗(yàn)結(jié)果顯示，各組家兔的采食、體溫、皮膚、毛發(fā)、眼、黏膜、呼吸、中樞神經(jīng)系統(tǒng)及四肢活動(dòng)等狀況均正常，未見(jiàn)中毒或異常癥狀，更未出現(xiàn)死亡情況。以上試驗(yàn)表明中藥“連蒲”乳房炎搽劑在3個(gè)月內(nèi)穩(wěn)定，無(wú)急性皮膚毒性，且安全性良好。

4.2 分析 中藥“連蒲”乳房炎搽劑選用的主藥為中草藥連翹和蒲公英?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，在金銀花、連翹和蒲公英三種中草藥中均未發(fā)現(xiàn)有毒成分；該搽劑的溶劑為50%乙醇，無(wú)毒無(wú)刺激性，而且密閉保存時(shí)不易揮發(fā)；添加的三種透皮吸收促進(jìn)劑中，除薄荷醇有輕微刺激作用外，氮酮和丙二醇均是無(wú)毒無(wú)刺激且不易揮發(fā)的化學(xué)物質(zhì)，而薄荷醇在該制劑中的含量?jī)H為4%，其刺激作用極小。因此，中藥“連蒲”乳房炎搽劑足以保證涂搽奶牛乳房皮膚時(shí)穩(wěn)定、安全、無(wú)刺激性。

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