奶牛子宮內(nèi)膜中大腸桿菌的分離鑒定及藥敏試驗

李小姝，蘇 慶

（1.重慶市合川區(qū)畜牧站，重慶 合川 401520；2.重慶市合川區(qū)渭沱鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，重慶 合川 401520）

子宮內(nèi)膜炎是奶牛最常見的一種生殖系統(tǒng)疾病，是引起奶牛不孕癥的主要原因之一。奶牛子宮內(nèi)膜炎的發(fā)病率很高，其病原比較復雜，細菌感染被認為是引起奶牛子宮內(nèi)膜炎的主要病原，引起子宮內(nèi)膜炎的細菌主要有葡萄球菌、鏈球菌、大腸埃希氏菌、棒狀桿菌、假單胞菌、變形桿菌、生殖器桿菌、嗜血桿菌、乳酸菌、化膿性放線桿菌、壞死性梭菌等。不同地區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎的病原分離結(jié)果差異極大，生物學特性及對不同藥物的敏感性亦存在較大差異。因此，探討不同地區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎的主要病原及生物學特性，對于有效控制本病具有重要意義。本試驗主要就合川區(qū)某奶牛場疑似奶牛子宮內(nèi)膜炎病例進行了細菌的分離鑒定，同時做了藥物敏感性試驗，現(xiàn)報告如下：

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料。病料來源于合川區(qū)某奶牛場7頭臨床型子宮內(nèi)膜炎患病牛。臨床采樣時，選擇正有分泌物流出的個體進行。先用消毒酒精對奶牛外陰及其周圍皮膚消毒，再用滅菌棉簽插入陰道內(nèi)4～6cm深度擦拭，收集陰道內(nèi)的子宮分泌物，將棉簽置于滅菌樣品瓶中，分別編號，置冰箱中4℃保存待檢。共收集病料7份。

1.1.2 主要試劑。蛋白胨、牛肉浸膏、SS瓊脂、麥康凱瓊脂等試劑，購自北京奧博星生物技術有限責任公司；瓊脂粉購自重慶東試化工有限公司。

1.1.3 腸桿菌科細菌生化編碼鑒定管GYZ-15e，購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.1.4 藥敏紙片。購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.1.5 試驗動物。30日齡健康昆明系小白鼠16只,雌雄各半，購自西南大學榮昌校區(qū)，用于分離細菌的致病性試驗。

1.2 方法

1.2.1 細菌的分離與純化。將采集的病料無菌接種于普通營養(yǎng)肉湯中，37℃恒溫振蕩，增菌培養(yǎng)24h。然后將增菌培養(yǎng)液作10-1～10-8稀釋，取10-8稀釋菌液0.1 mL接種于麥康凱瓊脂和SS瓊脂培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)24h。然后用細菌接種環(huán)挑取少許麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上紅色的、中央微凸起的菌落和SS瓊脂培養(yǎng)基上呈圓形、邊緣整齊的桃紅色單個菌落，再接種于麥康凱培養(yǎng)基上進行純培養(yǎng)，37℃恒溫培養(yǎng)18～24h。最后將分離菌株涂片，革蘭氏染色、鏡檢，進行菌體形態(tài)和染色特征觀察。

1.2.2 生化特性鑒定。將分離到的菌株接種到硫化氫、苯丙氨酸、枸櫞酸鹽、尿素、賴氨酸、葡萄糖、木膠糖等微量糖發(fā)酵管內(nèi)進行生化檢驗，同時進行吲哚、M-R、V-P試驗，置于37℃恒溫箱培養(yǎng) 12～24h，觀察產(chǎn)酸、產(chǎn)氣情況。

1.2.3 致病性試驗。將16只小白鼠隨機分為2組，試驗組、對照組各8只。隨機選取一株分離菌接種于普通肉湯中，37℃下培養(yǎng)18～24h，采用活菌計數(shù)法，配成含菌量約為1～2×109個/mL的菌液給小白鼠腹腔注射（0.2mL/只）；對照組則注射等量生理鹽水。接種后隔離飼養(yǎng)，觀察并記錄小白鼠的存活情況。將24～72h內(nèi)死亡的小白鼠剖檢，觀察病變，再取其心血、肝臟組織進行細菌分離鑒定，同樣對分離菌進行培養(yǎng)特性、形態(tài)、生化特性鑒定。

1.2.4 藥敏試驗。采用藥物紙片瓊脂擴散法對26種臨床常用抗菌藥進行敏感性觀察。用游標卡尺測量抑菌圈直徑。根據(jù)被測定藥物按常用劑量給藥時在體內(nèi)能達到的血藥濃度而將敏感性標準分為3級：高敏（S）、中敏（I）和耐藥（R），每株分離菌批內(nèi)設 3個重復，取其平均值，結(jié)果根據(jù)杭州天和微生物試劑有限公司提供的判斷標準進行；同時計算分離菌對某種抗菌素的耐藥率，耐藥率（%）=耐藥菌株數(shù)/試驗總菌株數(shù)×100%。

2 結(jié)果

2.1 分離菌株的培養(yǎng)特性、鏡檢特征 病料接種于普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基上，肉湯渾濁，液面有菌環(huán)；在麥康凱培養(yǎng)基上形成圓形、邊緣整齊、隆起、光滑、直徑為1～2.5mm的露珠狀紅色菌落；在SS瓊脂培養(yǎng)基上形成圓形、邊緣整齊、直徑為1～3mm的桃紅色菌落；鏡檢為紅色、兩端鈍圓的單個或成對排列的短桿菌。

2.2 分離菌株的生化特性 分離出的6株菌株均能發(fā)酵葡萄糖、木膠糖、山梨醇，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不發(fā)酵側(cè)金盞花醇、苯丙氨酸，不產(chǎn)生H2S；M-R呈陽性，V-P呈陰性。各菌株對其他生化發(fā)酵管的作用有一定的差異，菌株II的蛋白胨水試驗為陰性，而其他5株為陽性；菌株VI能發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，而其他菌株發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣；菌株II、IV、V能使賴氨酸產(chǎn)酸產(chǎn)氣，而其他菌株僅能使其產(chǎn)酸；菌株I、菌株II、菌株IV不發(fā)酵鳥氨酸，而其他菌株能使其產(chǎn)酸產(chǎn)氣；菌株II、菌株V不發(fā)酵棉籽糖，而其他菌株能發(fā)酵棉籽糖，并使其產(chǎn)酸產(chǎn)氣；除此之外，各株分離菌對山梨醇、木膠糖的生化反應結(jié)果也存在差異。詳見表1。

表1 分離菌株的生化試驗

2.3 分離菌的致病性試驗 隨機選取1株分離菌的稀釋液接種小白鼠，24 h后小白鼠開始出現(xiàn)死亡，36 h后死亡停止，精神、攝食、飲水等逐漸恢復正常；對照組在觀察期內(nèi)無死亡現(xiàn)象。剖檢死亡鼠可見其肝臟腫大質(zhì)脆，肺炎性水腫，有出血點，結(jié)腸、盲腸的漿膜和黏膜有充血或出血。采集死亡小白鼠的心血、肝臟組織接種到麥康凱培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h，可見上面有紅色菌落生長。其革蘭氏染色鏡檢及生化鑒定結(jié)果與分離菌相同。結(jié)果詳見表2。

表2 分離菌株接種后小白鼠的死亡情況

2.4 分離菌株的藥敏試驗 分離的6株菌對克林霉素、克拉霉素、阿奇霉素、林可霉素、紅霉素完全耐藥，耐藥率達100%；對利福平、新霉素、洛美沙星、大觀霉素等耐藥率也很高，耐藥率達66%以上；對頭孢曲松、頭孢哌酮、阿莫西林、頭孢唑啉、氨芐西林、多粘霉素B、痢特靈等高度敏感；對其他抗生素的耐藥性存在較大差異。詳見表3。

3 分析和討論

3.1 從7例臨床型子宮內(nèi)膜炎病料中分離到的6株細菌，經(jīng)試驗判定為E.coli，說明本奶牛場大腸桿菌的感染率較高,達85.7%（1/7）。這與報道的奶牛子宮內(nèi)膜炎主要病原菌為鏈球菌、葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌不一致。比較分析發(fā)現(xiàn)，合川區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎的發(fā)生，E.coli可能是主要致病菌，這可能與不同地區(qū)奶牛的飼養(yǎng)環(huán)境、奶牛的體況以及臨床用藥的習慣有關，因此要確切弄清一個地區(qū)或者一個奶牛場奶牛子宮內(nèi)膜炎的具體病原，必須進行實地調(diào)查和實驗室檢測。

表3 分離菌株的藥物敏感性試驗

3.2 本試驗對6株分離菌株做了生化特性鑒定，其中M-R試驗呈陽性，V-P試驗呈陰性，分離菌株均能發(fā)酵葡萄糖，但部分菌株不產(chǎn)氣，某些分離菌株能發(fā)酵棉籽糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，但其他菌株不能發(fā)酵棉籽糖。試驗發(fā)現(xiàn)每個菌株的生化試驗結(jié)果都存在一定的差異，這可能是大腸桿菌血清型不同所致，表明不同地區(qū)或同一地區(qū)的不同菌株，其生化特性的差異較大。

3.3 致病性試驗表明分離菌對小白鼠的致死率為25%，其致死率較低，說明分離的大腸桿菌毒力較弱。雖然分離菌毒力較弱，但臨床上可通過多種因素協(xié)同導致子宮內(nèi)膜炎發(fā)生。奶牛子宮內(nèi)膜炎的發(fā)生除病原微生物作用以外，還與奶牛日糧營養(yǎng)不全，維生素、微量元素及礦物質(zhì)缺乏或不足，母牛的抗病力低等密切相關；奶牛的肥瘦程度也是奶牛子宮內(nèi)膜炎發(fā)生的誘因之一。因此，奶牛場要有效控制子宮內(nèi)膜炎的大量發(fā)生，必須采取綜合措施才會達到理想的效果。

3.4 本試驗檢測了6株分離菌對26種抗菌藥物的耐藥性，結(jié)果表明，不同菌株對各種藥物的敏感性存在很大差異，提示在防治該病時應根據(jù)分離菌株的藥敏試驗結(jié)果（見表3）選擇用藥。值得注意的是，原本對大腸桿菌有效的阿米卡星、慶大霉素等氨基糖苷類藥物及環(huán)丙沙星等喹諾酮類藥物現(xiàn)已開始產(chǎn)生耐藥性。

4 結(jié)論

合川區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎的主要病原為大腸桿菌，但本地大腸桿菌的毒力較弱，其對頭孢曲松、阿莫西林等β-內(nèi)酰胺類抗生素及多粘霉素B、痢特靈高度敏感，對克林霉素、克拉霉素、阿奇霉素、林可霉素、紅霉素完全耐藥。

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