胰高血糖素樣肽－1可改善高糖環(huán)境下人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激

王麗靜，陳麗云，劉曉紅，陳 洲，劉禮斌

2.福建醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，福州 350108

糖尿病血管并發(fā)癥是糖尿病致死致殘的主要原因，而內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂是糖尿病心血管疾病發(fā)生的始動(dòng)環(huán)節(jié)[1]。高血糖是最重要的刺激因素，大量研究表明，其作用機(jī)制與誘導(dǎo)機(jī)體氧化應(yīng)激密切相關(guān)[2－3]。氧化應(yīng)激是自由基引起的一種負(fù)面效應(yīng)，其自由基主要包括活性氧（reactive oxygen species，ROS）、活性氮和親電子體等。機(jī)體的抗氧化防御機(jī)制主要成分包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH－PX）等，其中SOD是抗氧化防御的第一線。

胰高糖素樣肽－1（glucagon－like peptide－1，GLP－1）是近年來糖尿病研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，因其可促進(jìn)胰島素的分泌，抑制胰高血糖素的分泌而用于糖尿病的臨床治療中。此外，研究發(fā)現(xiàn)GLP－1對內(nèi)皮細(xì)胞功能亦有保護(hù)作用[4]，但其機(jī)制尚不清楚。本研究觀察GLP－1對高糖培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical veine ndothelial cells，HUVECs）功能的作用，并進(jìn)一步探討其對氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)變化的影響，以期為更好地理解GLP－1的糖尿病心血管保護(hù)作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 臍帶標(biāo)本采自福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院健康孕婦剖腹產(chǎn)后，立即對HUVECs進(jìn)行分離培養(yǎng)。

1.1.2 試劑 M199培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶（美國Gibco公司），內(nèi)皮細(xì)胞生長添加劑（美國BD公司），GLP－1（7－36）（美國 Sigma公司），膠原酶Ⅰ（美國Invitrogen公司），SOD活力檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所），乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測試劑盒、NO（DAF－FMDA探針法）檢測試劑盒（杭州碧云天生物技術(shù)研究所）。

1.1.3 儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱（MCO－15AC，日本SANYO公司），熒光酶標(biāo)儀（Thermo scientific公司），倒置顯微鏡（CKS41，日本Olympus公司）。

1.2 方法

1.2.1 原代 HUVECs的分離、培養(yǎng) 取當(dāng)天剖腹產(chǎn)新鮮臍帶10～15cm，洗凈臍帶表面的殘留血液，無菌手術(shù)刀片部分切除其一端，辨別臍帶靜脈，以雙抗PBS充分沖洗臍靜脈至流出液體中無血性液體，灌入0.1%膠原酶Ι在37℃條件中消化15min。消化結(jié)束后PBS沖洗臍帶，收集消化液離心后棄上清，加入4mL 10%M199培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，接種到塑料培養(yǎng)瓶中，37℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3d換液1次，當(dāng)細(xì)胞生長融合達(dá)80%～90%時(shí)，消化、傳代接種于培養(yǎng)板上。

1.2.2 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞鑒定 取生長良好的第三代細(xì)胞按105mL－1細(xì)胞密度接種于6孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24h。以4%多聚甲醛中固定，PBS清洗后加入0.5%Triton X－100破膜處理，加入3%H2O2室溫浸泡20min；5%BSA封閉20min。滴加兔抗人Ⅷ因子抗體，置于濕盒中4℃過夜。滴加山羊抗兔二抗（HRP標(biāo)記），37℃孵育20min。將DAB顯色劑混勻后加至爬片，室溫避光顯色，當(dāng)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕褐色顆粒時(shí)終止顯色，蒸餾水沖洗干凈。蘇木素精復(fù)染2min。脫水，透明，封片，顯微鏡觀察拍照。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組 將 HUVECs細(xì)胞分為：對照組，不做任何處理；高糖組，30mmol／L D－葡萄糖培養(yǎng)；GLP－1預(yù)處理組，先加入GLP－1 100nmol／L預(yù)處理1h，后以30mmol／L D－葡萄糖培養(yǎng)7d。

1.2.4 乳酸脫氫酶釋放檢測細(xì)胞毒性定量分析細(xì)胞按1.2.3實(shí)驗(yàn)組別進(jìn)行分組干預(yù)。干預(yù)結(jié)束后，取細(xì)胞上清液。將120μL待檢樣本及60mL LDH檢測工作液（乳酸溶液、INT溶液、酶溶液按1∶1∶1）混勻，室溫孵育30min；酶標(biāo)儀下測定吸光度（使用490nm和620nm雙波長測定）；按公式：

計(jì)算評價(jià)細(xì)胞毒性情況。

1.2.5 熒光酶標(biāo)儀檢測ROS水平 細(xì)胞按1.2.3實(shí)驗(yàn)組別進(jìn)行分組干預(yù)；各組加入適量DCFH－DA 10μmmol／L于培養(yǎng)基中，37℃避光孵育30min。加入胰酶消化后制備細(xì)胞懸液。細(xì)胞計(jì)數(shù)后每組取等數(shù)量的細(xì)胞，用PBS重懸細(xì)胞沉淀，按200μL／孔加樣于96孔黑色檢測板中；熒光酶標(biāo)儀（激發(fā)波長500nm、發(fā)射波長525nm）下檢測各組熒光強(qiáng)度。

1.2.6 黃嘌呤氧化酶法測定細(xì)胞內(nèi)SOD活性 細(xì)胞按1.2.3實(shí)驗(yàn)組別進(jìn)行分組干預(yù)，細(xì)胞刮刀刮下各組細(xì)胞，PBS清洗后4℃離心（2 000g，10min）分別收集細(xì)胞沉淀；收集細(xì)胞沉淀以超聲破碎，向各孔加入反應(yīng)物，37℃孵育20min，酶標(biāo)儀（450nm處）檢測OD值。SOD抑制率及活性的計(jì)算公式如下：

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 結(jié)果以±s表示，采用SPSS 11.5軟件處理數(shù)據(jù)。多組間比較采用單因素方差分析（One－way ANOVA）或秩和檢驗(yàn)，以P＜0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HUVECs培養(yǎng)及鑒定 原代內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)3h后開始貼壁，24h完全貼壁，早期貼壁細(xì)胞呈短梭形，細(xì)胞多成團(tuán)生長，少數(shù)細(xì)胞分散生長；5～7d細(xì)胞單層鋪滿呈鋪路石樣生長（圖1A）。內(nèi)皮細(xì)胞FⅧ抗原相關(guān)染色鑒定，F(xiàn)Ⅷ是由因子FⅧ促凝成分（FⅧ∶C）和內(nèi)皮細(xì)胞合成的vWF（von Willebrand factor）組成的一種復(fù)合物，內(nèi)皮細(xì)胞鑒定即是通過觀察FⅧ因子免疫組織化學(xué)染色完成，F(xiàn)Ⅷ抗原陽性細(xì)胞表現(xiàn)為胞漿中可見染成棕褐色的顆粒，即為HUVECs（圖1B）。

圖1 原代HUVECs培養(yǎng)及鑒定Fig 1 Culture and identification of HUVECs

2.2 GLP－1可降低高糖環(huán)境對HUVECs的毒性作用 以各處理組細(xì)胞上清中LDH漏出量與對照組細(xì)胞上清中LDH漏出量的百分比值評價(jià)細(xì)胞毒作用，結(jié)果表明30mmol／L葡萄糖作用7d對細(xì)胞有明顯的毒性作用（圖2），高糖組LDH漏出量為對照組的（181.07±3.35）%，GLP－1預(yù)處理組 LDH漏出量為對照組的（134.94±1.78）%（vs對照組，P＜0.01），比高糖組降低了46.13%（vs高糖組P＜0.01）。

2.3 GLP－1可降低高糖誘導(dǎo) HUVECs產(chǎn)生的ROS水平 與對照組比較，單獨(dú)高糖處理4d即可使HUVECs細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生增多近60%[（224.85±4.73）vs（141.80±3.79），P＜0.01]；7d則可使細(xì)胞內(nèi)ROS增加1倍以上[（300.00±4.73）vs（137.58±7.37），P＜0.01]。選取高糖作用7d誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型，同時(shí)行GLP－1預(yù)處理聯(lián)合高糖共同作用，觀察GLP－1對高糖下內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用。GLP－1預(yù)處理組細(xì)胞內(nèi)ROS水平強(qiáng)度比單獨(dú)高糖處理組降低了46.18%[（156.68±9.40）vs（291.14±12.21），P＜0.01]（圖3）。

圖2 胰高糖素樣肽－1可降低高糖環(huán)境對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的毒性Fig 2 GLP－1could reduce toxicity of high glucose in HUVECs

圖3 胰高糖素樣肽－1可降低高糖誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基水平Fig 3 GLP－1could decrease high glucoseinduced ROS in HUVECs

2.4 GLP－1可提高高糖環(huán)境下HUVECs細(xì)胞內(nèi)SOD活力 與對照組比較，單獨(dú)高糖處理7d組細(xì)胞內(nèi) SOD 酶活性無明顯改變 [（23.81±1.41）vs（22.48±2.19）U／mgprot，P＞0.05]；GLP－1 預(yù)處理組SOD酶活性比單獨(dú)高糖處理組升高了64.64%[（22.48±2.19）vs（39.20±2.21）U／mgprot，P＜0.01]（圖4）。

圖4 胰高糖素樣肽－1提高高糖環(huán)境下人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶活力Fig 4 GLP－1could increase the activity of SOD in HUVECs in high glucose

3 討 論

在針對糖尿病心血管病變分子機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn)，高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂是通過氧化應(yīng)激實(shí)現(xiàn)的[6]。高糖通過非酶糖基化形成糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycationend products AGES）、激活多元醇途徑等生成大量ROS[7]。機(jī)體的抗氧化防御機(jī)制包括兩大系統(tǒng)：清除各種活性氧和自由基的酶性抗氧化系統(tǒng)和非酶性抗氧化劑。酶性抗氧化系統(tǒng)主要包括SOD、GSH－PX和過氧化氫酶等。SOD是金屬酶，能催化超氧陰離子的歧化反應(yīng)，是抗氧化防御的第一線。過多的ROS超過機(jī)體抗氧化能力時(shí)消耗NO，導(dǎo)致血管舒張功能障礙，同時(shí)發(fā)揮細(xì)胞毒性損傷作用，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，破壞內(nèi)膜完整性從而促發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程。

GLP－1及其類似物作為一類新的降糖藥物已成功地應(yīng)用于2型糖尿病的治療。它通過葡萄糖依賴性地作用于胰島β細(xì)胞促進(jìn)胰島素的合成和分泌；抑制餐后胃排空、抑制食欲及促進(jìn)肝臟、肌肉、脂肪組織糖原合成增多等機(jī)制來降低血糖。在針對其臨床應(yīng)用的薈萃分析中提示GLP－1還具有獨(dú)立于上述作用之外的潛在的心血管保護(hù)作用[8]：可以改善內(nèi)皮功能、促進(jìn)心肌葡萄糖攝取、增加左室心功能和射血分?jǐn)?shù)等。Nystrom等觀察到GLP－1可以增加內(nèi)皮依賴的血管舒張程度，提示其具有內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用[9]。Younce等認(rèn)為GLP－1發(fā)揮抗凋亡的作用與其抑制其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)[10]。但尚缺乏足夠的基礎(chǔ)研究方面的依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)通過檢測ROS、SOD活力等指標(biāo)闡明細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)與抗氧化能力。文獻(xiàn)報(bào)道，利用高糖或其生成的AGES均可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞ROS的升高，導(dǎo)致其功能障礙[11－12]。本研究在觀察高糖培養(yǎng)HUVECs過程中，培養(yǎng)液中LDH的含量升高了1.8倍，證實(shí)了高糖對內(nèi)皮細(xì)胞的毒性作用。同時(shí)觀察到高糖培養(yǎng)4d開始細(xì)胞內(nèi)ROS明顯升高，7d ROS成倍升高，而細(xì)胞內(nèi)SOD活力與對照組比較，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證實(shí)高糖可使內(nèi)皮細(xì)胞ROS不斷積聚，最終超出抗氧化系統(tǒng)的清除能力，導(dǎo)致細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)，發(fā)揮細(xì)胞毒性損傷作用，研究結(jié)果與以往的文獻(xiàn)報(bào)道一致。而在本課題組的前期研究中也證實(shí)了氧化劑第三丁基過氧化氫（t－BHP）可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷，使細(xì)胞一氧化氮合成酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）蛋白表達(dá)增加，胞內(nèi) NO 水平增高[13]。

大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，通過添加抗氧化劑或過表達(dá)SOD或過氧化氫酶能夠預(yù)防組織細(xì)胞的病變，間接證明了ROS在糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生中起著重要作用。Yao等認(rèn)為AGES誘導(dǎo)細(xì)胞功能障礙的關(guān)鍵機(jī)制是高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激[14]，長期的高糖刺激下調(diào)乙二醛酶－1活性及基因蛋白表達(dá)，在過表達(dá)SOD基因后，乙二醛酶－1活性及表達(dá)得到恢復(fù)，AGES減少。本實(shí)驗(yàn)中，與單獨(dú)高糖組比較，GLP－1干預(yù)后培養(yǎng)液中LDH的含量降低了46.13%，提示GLP－1可以減輕高糖對內(nèi)皮細(xì)胞的毒性作用，同時(shí)伴隨著細(xì)胞內(nèi)ROS降低，SOD活力升高。Ding等研究發(fā)現(xiàn)，GLP－1可以激活eNOS的活性，促進(jìn)eNOS磷酸化，上調(diào)eNOS蛋白表達(dá)[15]。Shiraki等發(fā)現(xiàn)，GLP－1類似物利拉魯肽可以抑制腫瘤壞死因子誘導(dǎo)的HUVECs的ROS產(chǎn)生[16]，同時(shí)可以增加SOD、過氧化氫酶、GSH－PX等抗氧化酶的合成。以上均提示GLP－1可能是通過上調(diào)細(xì)胞內(nèi)氧化防御系統(tǒng)的活性，減輕氧化應(yīng)激，提高內(nèi)皮細(xì)胞抗凋亡能力，改善內(nèi)皮細(xì)胞功能。但對于GLP－1改善內(nèi)皮細(xì)胞功能的具體信號機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，GLP－1可以改善高糖對 HUVECs的細(xì)胞毒性作用，保護(hù)高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，機(jī)制可能是通過減輕細(xì)胞氧化應(yīng)激來實(shí)現(xiàn)的。研究結(jié)果將為臨床應(yīng)用GLP－1及其類似物治療2型糖尿病、改善患者的心血管功能和減少心血管并發(fā)癥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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