益腸平對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸通透性的預防作用

黃循銣，王瑞幸，王承黨

2.福建醫(yī)科大學 生理學與病理生理學系，福州 350004

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種病因不明的終身性疾病，主要表現(xiàn)為非特異性結(jié)、直腸炎癥。目前UC主要治療藥物有氨基水楊酸、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、生物制劑及中藥[1]，益腸平是民間治療UC有效的中藥復方。本文采用2.5%葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）定量灌胃誘導小鼠UC，并通過測定結(jié)腸損傷大體評分（macroscopic assessment of colonic damage，MACN）、結(jié)腸通透性、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、結(jié)腸組織超氧化歧化酶（superoxide dismutase，SOD）及誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS），評價益腸平對UC小鼠結(jié)腸通透性的預防作用，并初步了解其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 清潔級雄性ICR小鼠120只，8～10周齡，體質(zhì)量（27±2）g[福建醫(yī)科大學實驗動物中心，許可證號SCXK（閩）2009－0002]。

1.1.2 試劑及儀器 益腸平（由連翹、蚤休及泡山甲等12種中藥組成）生藥濃度1.235g／mL，由福建醫(yī)科大學藥學系提供；DSS（批號：4455H，美國ICN公司）；伊文思蘭（批號：104K3717，美國Sigma公司）；iNOS一抗（批號：9242P503B，美國 Labvision公司）；二步法抗兔免疫組織化學檢測試劑盒（批號：GK400305，廣州基因有限公司）；柳氮磺吡啶（Sulfasalazine suppositories，SASP，批號20090523，上海三維制藥有限公司）；SOD（批號20090413）、MDA（批號20090421）試劑盒（南京建成生物工程研究所）。正置顯微鏡（BX50F型，日本Olympus optical有限公司）；超聲波細胞粉碎儀（GE50型，美國Thomas scientific公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組 小鼠隨機分為6組，每組20只：（1）正常 對照組；（2）模型對照組；（3）SASP 組；（4）益腸平高劑量組（YCP1）；（5）益腸平中劑量組（YCP2）；（6）益腸平低劑量組（YCP3）。

1.2.2 UC模型制作 模型對照組、SASP組及YCP1、YCP2及 YCP3組每天分別于10：00、14：00和18：00給予2.5%DSS溶液定量灌胃，每次30mL／kg，每天末次灌胃后給予足量混合配方顆粒飼料，次日08：00取走飼料，連續(xù)9d；正常對照組以蒸餾水代替2.5%DSS[2]。

1.2.3 治療 造模開始同時給藥：YCP1、YCP2及YCP3組分別給予相同容積（0.125mL／10g體質(zhì)量）、不同生藥濃度（0.617、0.308、0.154g／mL）的益腸平溶液，每日2次，即每只小鼠用藥量分別為30.8、15.4、7.7g·kg－1·d－1。SASP組給予相同容積（0.125mL／10g體質(zhì)量）的0.8%SASP懸液，每日2次。以上藥液均為灌胃，給藥時間距DSS給藥時間2h，連續(xù)9d。正常對照組及模型對照組以蒸餾水代藥[2]。

1.3 觀測指標

1.3.1 MACN評分 各組隨機取10只小鼠脫頸椎處死，取全結(jié)腸，漂洗后于解剖顯微鏡下觀察及評分。MACN＝潰瘍評分＋粘連評分＋糞便評分。潰瘍評分：0分：正常；1分：局部水腫、無潰瘍；2分：一個潰瘍，無增厚、水腫；3分：一個潰瘍伴增厚、水腫；4分：最明顯的潰瘍沿腸壁縱軸的長度＞1cm；5～10分：潰瘍長度沿結(jié)腸縱軸＞2cm（每一潰瘍增加1cm增加1分）。粘連評分：0分：無；1分：較少；2分：較多，不易分離。稀便：0分：無；1分：有[3]。

1.3.2 結(jié)腸通透性測定 取余下10只小鼠禁食不禁水24h，經(jīng)肛門插入直徑為1mm硅膠管，注入0.5%肥皂水洗腸，15min后用清水沖洗2次。洗腸后30min，氯胺酮麻醉下自小鼠結(jié)腸給予1.5%伊文思蘭0.2mL，立即縫合肛門。15min后處死小鼠，取全結(jié)腸，剪開腸腔，用6mmol／L N－乙酰半胱氨酸漂洗。將腸段置于恒溫箱37℃12h烘干，稱重后放入1mL甲酰胺55℃孵育24h，取100μL孵育液于酶標儀上測定620nm波長處的吸光度，計算伊文思藍量。以進入腸壁內(nèi)伊文思蘭的量（μg／mg腸段質(zhì)量）反映結(jié)腸通透性[4]。

1.3.3 結(jié)腸組織MDA及SOD測定 取病變最明顯處0.5cm結(jié)腸組織，制備10%組織勻漿，經(jīng)3次凍融后離心取上清液提純。結(jié)腸黏膜MDA及SOD的測定按試劑盒說明進行[4]。

1.3.4 結(jié)腸組織iNOS測定 取病變較明顯的部位0.5cm，常規(guī)固定、包埋、切片，采用免疫組織化學Envison TM二步法測定。結(jié)腸iNOS表達以細胞漿染為棕色或淺棕色為陽性，采用Image Pro－Plus 5.1圖像分析軟件進行定量分析。比較各組小鼠結(jié)腸組織單位面積陽性細胞數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 MACN評分 造模后3d模型小鼠均逐漸出現(xiàn)腹瀉、血便、消瘦等類似人類UC的表現(xiàn)。造模后9d正常對照組小鼠結(jié)腸黏膜光整，模型對照組結(jié)腸短縮，黏膜充血水腫明顯，見淺表潰瘍形成，部分見息肉樣隆起，其余各組結(jié)腸黏膜充血水腫較模型對照組減輕。模型對照組MACN評分較正常對照組顯著增高，SASP組、YCP1、YCP2、YCP3組較模型對照組顯著降低，差別有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。YCP1、YCP2、YCP3組與SASP組比較，差別無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表1）。

2.2 結(jié)腸通透性 正常對照組結(jié)腸粘膜光整，少許呈淡藍色；模型對照組結(jié)腸粘膜充血水腫，病變處呈深藍色。模型對照組結(jié)腸通透性較正常對照組顯著增高，差別有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；SASP組及YCP1、YCP2、YCP3組較模型對照組顯著降低，差別有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；SASP組較 YCP1、YCP2、YCP3組差別無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表1）。

2.3 結(jié)腸組織MDA、SOD水平 模型對照組較正常對照組小鼠結(jié)腸MDA水平顯著增高、SOD水平顯著降低，差別有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；SASP組、YCP1、YCP2、YCP3組與模型對照組比較，差別有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；SASP組與 YCP1、YCP2、YCP3組比較，差別無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表1）。

2.4 結(jié)腸組織iNOS表達 正常對照組iNOS無表達或僅少量表達于結(jié)腸黏膜上皮細胞的胞漿。模型對照組較正常對照組表達明顯增多，陽性區(qū)域位于結(jié)腸黏膜上皮細胞，腸腺上皮細胞，炎癥細胞及血管內(nèi)皮細胞的胞漿。模型對照組iNOS陽性單位數(shù)值較正常對照組顯著增高，差別有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；SASP組、YCP1、YCP2、YCP3組較模型對照組顯著降低，差別有統(tǒng)計學意義；SASP組較YCP2、YCP3組表達較低，差別有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖1，表1）。

表1 各組小鼠MACN評分、結(jié)腸通透性（EB／腸質(zhì)量）、結(jié)腸MDA、SOD及iNOS的表達情況Tab 1 MACN，colonic permeability，MDA，SOD and iNOS expression level in different groups mouse

2.5 結(jié)腸通透性、MACN 評分、MDA、SOD 及iNOS的相關性分析 Pearson相關分析提示，小鼠結(jié)腸通透性與 MACN評分（r＝0.511，P＝0.009）、MDA（r＝0.470，P＝0.011）、iNOS（r＝0.542，P＝0.006）均有顯著正相關；與SOD（r＝－0.520，P＝0.007）呈顯著負相關。

3 討 論

UC以腹痛、腹瀉及黏液血便為主要癥狀，其發(fā)病機制未明。近年來，結(jié)腸屏障受損、結(jié)腸通透性增高逐漸成為UC發(fā)病機制研究的熱點。結(jié)腸屏障由機械屏障、免疫屏障、化學屏障和生物屏障組成。當結(jié)腸屏障受損后，結(jié)腸通透性增高，腸腔內(nèi)的細菌或食物等抗原進入腸壁，啟動腸道粘膜免疫反應進而導致腸道免疫及炎癥反應。通過人類炎性腸病患者及一些動物模型的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，腸道通透性的改變在疾病發(fā)病數(shù)月之前就已出現(xiàn)，它可能是UC起病及反復發(fā)作的一個重要環(huán)節(jié)[5]。本研究采用2.5%DSS定量灌胃成功誘發(fā)小鼠UC，造模小鼠出現(xiàn)明顯的腹瀉、粘液血便，類似人類UC。UC小鼠結(jié)腸通透性與MACN明顯增高并呈密切正相關。與模型組比較，益腸平治療組MACN及結(jié)腸通透性明顯降低，差別有統(tǒng)計學意義，提示益腸平對UC小鼠結(jié)腸大體病理表現(xiàn)及降低結(jié)腸通透性均有顯著的改善作用。

腸道通透性受TNF－α等多種前炎癥因子網(wǎng)絡調(diào)節(jié)，并與腸黏膜的氧化應激狀況有關[4]。液體及溶質(zhì)主要通過經(jīng)細胞轉(zhuǎn)運途徑和細胞旁路途徑兩種方式進入結(jié)腸黏膜，后者主要是通過黏膜上皮細胞間的緊密連接來實現(xiàn)，是中、大分子通過腸道屏障的重要途徑。已有研究表明，結(jié)腸自由基產(chǎn)生增加，可導致結(jié)腸屏障受損，結(jié)腸通透性增高[4]。自由基包括氧自由基和NO自由基，SOD反映了組織清除氧自由基的能力，而MDA則是脂質(zhì)代謝產(chǎn)物，它們反映了細胞受氧自由基攻擊的嚴重程度。而測定結(jié)腸組織iNOS，可以反映結(jié)腸NO自由基損傷程度。

益腸平由銀花、連翹、蒲公英、蚤休、茵陳以及赤芍等12種中藥組成。體內(nèi)、外實驗研究已經(jīng)表明，本方所含的銀花、連翹、蒲公英、蚤休對結(jié)腸桿菌、痢疾桿菌等腸道細菌有較強的抗菌作用；連翹有降低血管內(nèi)皮滲透性的作用；茵陳有清熱抑菌，抑制腸管過度蠕動的作用。本配方是在用于臨床治療泄瀉的經(jīng)驗方取得較好療效的基礎上，結(jié)合本病以免疫異常及感染為主要因素的發(fā)病機制，以健脾滲濕、去腐排膿、生肌斂瘡為治則配方而成，旨在消除潰瘍、調(diào)節(jié)免疫、促進炎癥吸收的作用。本研究結(jié)果提示，UC小鼠結(jié)腸SOD水平明顯降低，MDA及iNOS水平明顯增高，顯示UC小鼠結(jié)腸受自由基損傷明顯，益腸平治療后上述指標明顯改善，并呈劑量依賴性。各組小鼠自由基水平與結(jié)腸通透性密切相關，提示益腸平可能通過降低結(jié)腸黏膜自由基水平而降低結(jié)腸通透性。

綜上所述，益腸平能有效改善UC小鼠結(jié)腸通透性，這可能基于其可有效降低UC小鼠結(jié)腸自由基損傷、保護結(jié)腸屏障，但其進一步的分子機制尚需今后進一步研究。

[1]王瑞幸，黃循銣，方秋娟，等.補黃丹對小鼠免疫性潰瘍性結(jié)腸炎的治療作用[J].福建醫(yī)科大學學報，2006，40（1）：37－39.

[2]黃循銣，王承黨，王瑞幸.葡聚糖硫酸鈉自由飲用與定量灌胃誘導急性結(jié)腸炎模型的對比研究[J].胃腸病學，2009，14（1）：27－30.

[3]Fitzpatrick L R，Small J S，Doblhofer R，etal.Vidofludimus inhibits colonic interleukin－17and improves hapten－induced co－litis in rats by a unique dual mode of action[J].Pharmacol ExpTher，2012，342（3）：850－860.

[4]黃循銣，王瑞幸，王承黨.小鼠潰瘍性結(jié)腸炎結(jié)腸通透性改變及其與自由基的關系[J].中華消化雜志，2010，3（1）：557－559.

[5]Yan Y，Laroui H，Ingersoll A，etal.Overexperssion of Ste20－related proline／alanine－rich kinase exacerbates experimental colitis in mice[J].JImmunol，2011，187（3）：1496－1505.