吉非替尼聯(lián)合5－氟尿嘧啶對(duì)肺癌細(xì)胞株A549的影響及機(jī)制研究＊

西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 （西安710061）

崔 潔△ 王敏聰 郭亞煥▲ 宋麗萍

肺癌是最常見(jiàn)惡性腫瘤之一，其中約80%為非小細(xì)胞肺癌，惡性程度高，總體5年生存率僅為15%，大多數(shù)患者就診時(shí)為中晚期，化療和分子靶向治療是治療的主要手段，但容易出現(xiàn)耐藥［1］。表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑（EGFR－TKI）包括吉非替尼、厄洛替尼和?？颂婺幔壳氨籒CCN指南推薦用于晚期非小細(xì)胞肺癌的治療，通過(guò)干預(yù)EGFR酪氨酸激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制腫瘤細(xì)胞的存活、血管生成、增殖、細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移等過(guò)程［2］。然而，EGFR－TKI只對(duì)部分患者有效，且經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的治療后出現(xiàn)疾病進(jìn)展，即發(fā)生了獲得性耐藥，這種耐藥可能與EGFR基因的二次突變有關(guān)［3，4］。因此，克服 EGFR－TKI的原發(fā)性和獲得性耐藥是一項(xiàng)重要的研究課題。

本實(shí)驗(yàn)將探討5－氟尿嘧啶聯(lián)合吉非替尼對(duì)A549細(xì)胞的影響及其機(jī)制，為提高非小細(xì)胞肺癌患者對(duì)EGFR－TKI的敏感性提供新的思路。

材料和方法

1 材 料 人肺腺癌細(xì)胞株A549由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室提供，吉非替尼由英國(guó)阿斯利康公司提供，5－氟尿嘧啶購(gòu)自上海旭東海普藥業(yè)，PⅠ染料購(gòu)自Sigma公司，RPMⅠ－1640培養(yǎng)液和胎牛血清購(gòu)自四季青公司，細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自自碧云天生物技術(shù)有限公司，MTT購(gòu)自Sigma公司，DNA提取試劑盒購(gòu)自TakaRa寶信生物工程有限公司，流式細(xì)胞儀為美國(guó)BD公司，p－EGFR購(gòu)自Cell Signaling Technology，EGFR 購(gòu)自bioworld technology，β－actin購(gòu)自sinopept company。

2 方 法

2．1 細(xì)胞培養(yǎng)：將人A549細(xì)胞系培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100U／ml青霉素及100ug／ml鏈霉素的PRMI－1640培養(yǎng)基中，置于含5%CO2、100%飽和濕度、37℃孵箱中培養(yǎng)，隔天傳代。

2．2 四甲基偶氮唑鹽（MTT）法檢測(cè)細(xì)胞增殖：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104／ml，接種于96孔培養(yǎng)板，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h，加入不同濃度的5－Fu（1．2，2．4，4．8，8．6，17．2，34．4μmol／L）和吉非替尼（1．6，3．2，6．4，12．8，25．6，51．2μmol／L）48h后檢測(cè)，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。藥物聯(lián)合作用的檢測(cè)，每孔內(nèi)分別加入含有終濃度為0．125，0．25，0．5，1，2倍IC50濃度的吉非替尼以及0．125，0．25，0．5，1，2，4倍IC50濃度的5－Fu共同孵育，48h后終止培養(yǎng)，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每孔加入MTT20μL，避光培養(yǎng)4h后去培養(yǎng)液，每孔加入DMSO150μL，于振蕩器上搖勻后于酶標(biāo)儀上測(cè)OD492值，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照和無(wú)細(xì)胞空白對(duì)照。計(jì)算細(xì)胞抑制率＝（實(shí)驗(yàn)組平均A值／對(duì)照組平A值）×100%。采用直線回歸方法計(jì)算藥物的半數(shù)抑制濃度（IC50）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2．3 吉非替尼和5－氟尿嘧啶的聯(lián)合效應(yīng)：根據(jù)中效原理，采用Chou－Talalay方法判定2種藥物的聯(lián)合作用。按中效方程式計(jì)算出不同抑制率時(shí)兩藥的單用和聯(lián)用濃度，通過(guò)單藥和二藥合用量效關(guān)系參數(shù)計(jì)算聯(lián)合用藥效應(yīng)值與二藥單用效應(yīng)值的關(guān)系，求出各抑制水平的聯(lián)合指數(shù)（Combination Index，CI），如果 CI＜1，認(rèn)為兩藥物聯(lián)用為協(xié)同作用；如果CI＝1，認(rèn)為兩藥聯(lián)用為相加作用；如果CI＞1，則認(rèn)為兩藥聯(lián)用為拮抗作用。

2．4 應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞，接種于6孔培養(yǎng)板，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105／孔，12h后分別應(yīng)用吉非替尼（5μmol／L），5－氟尿嘧啶（4．8μmol／L），吉非替尼聯(lián)合5－氟尿嘧啶處理細(xì)胞，同時(shí)應(yīng)用1／1000DMSO作為陰性對(duì)照，48h后終止培養(yǎng)，胰酶消化，PBS洗滌，棄上清，加入200μL試劑盒提供的結(jié)合緩沖液，重懸細(xì)胞后，分別加入10μLAnnexinV－FITC和5μLPI，輕輕混勻，4℃避光反應(yīng)30min，再加入300μL結(jié)合緩沖液，上機(jī)檢測(cè)。

2．5 應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞，接種于6孔培養(yǎng)板，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105／孔，12h后應(yīng)用吉非替尼（5μmol／L）處理細(xì)胞，同時(shí)應(yīng)用1／1000DMSO作為陰性對(duì)照，48h后終止培養(yǎng)，0．25%胰酶消化，1500r／min離心5min，棄上清，用冷PBS洗滌2次，70%酒精固定4℃過(guò)夜，離心后去上清，用冷 PBS洗滌2次，加入500μLAssay Buffer＋10μLRNase A＋10μLPI，避光室溫孵育30min，上機(jī)檢測(cè)。

2．6 Western－blot檢測(cè)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞，接種于6孔培養(yǎng)板，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105／孔，12h后分別應(yīng)用吉非替尼（5μmol／L），5－氟尿嘧啶（4．8μmol／L），吉非替尼聯(lián)合5－氟尿嘧啶處理細(xì)胞，同時(shí)應(yīng)用1／1000DMSO作為陰性對(duì)照，48h后終止培養(yǎng)，收集細(xì)胞，提取蛋白，并用紫外吸收法測(cè)定蛋白濃度。SDS－PAGE分離蛋白后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，將轉(zhuǎn)上蛋白的聚偏二氟乙烯（PVDF）膜置于含5%脫脂奶粉的Tris鹽緩沖液－吐溫液（TBST）中封閉1h，TBST漂洗。分別加入抗人EGFR／p－EGFR一抗4℃孵育過(guò)夜，TBST漂洗3次，每次10min。然后再加入相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，在室溫下孵育1h后，充分漂洗，最后采用電化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯像，暗室中進(jìn)行X射線曝光壓片，再顯影，定影，得到目的蛋白條帶。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，用β－αctin作為內(nèi)參。

結(jié) 果

1 吉非替尼和5－氟尿嘧啶對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的增殖抑制 應(yīng)用MTT法分別檢測(cè)吉非替尼和5－氟尿嘧啶作用于非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞48h的增殖抑制效應(yīng)，研究結(jié)果顯示，隨著藥物濃度的提高，細(xì)胞抑制率逐漸增高，48h半數(shù)抑制率（IC50）見(jiàn)附表。

附表 半數(shù)抑制率（±s）

附表 半數(shù)抑制率（±s）

藥物 吉非替尼（μmol／L） 5－氟尿嘧啶（μmol／L）IC50 12．3±1．5 8．8±1．7

2 吉非替尼和5－氟尿嘧啶聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同效應(yīng) 應(yīng)用 MTT法檢測(cè)聯(lián)合0．125，0．25，0．5，1，2倍IC50濃度的吉非替尼和0．125，0．25，0．5，1，2倍IC50濃度的5－氟尿嘧啶對(duì)A549細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)，然后采用Chou－Talalay聯(lián)用指數(shù)法判定2種藥物的聯(lián)合作用。研究結(jié)果顯示吉非替尼和5－氟尿嘧啶聯(lián)用具有協(xié)同效應(yīng)，CI值＜1，隨著藥物濃度增高，CI值逐漸減小，協(xié)同效應(yīng)更加顯著。

3 聯(lián)合吉非替尼和5－氟尿嘧啶對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響 應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)吉非替尼（5μmol／L），5－氟尿嘧啶（4．8μmol／L），吉非替尼聯(lián)合5－氟尿嘧啶作用于A549細(xì)胞48h后對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，同時(shí)應(yīng)用1／1000DMSO作為陰性對(duì)照，研究結(jié)果顯示吉非替尼或5－氟尿嘧啶單獨(dú)作用A549細(xì)胞48h后，細(xì)胞凋亡率分別為1．35%±0．5%和1．41%±0．7%，陰性對(duì)照組0．81%±0．2%；吉非替尼和5－Fu聯(lián)合作用于A549細(xì)胞的凋亡率為7．23%±1．5%，高于單獨(dú)用藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。

4 吉非替尼對(duì)A549細(xì)胞細(xì)胞周期的影響 吉非替尼（5μmol／L）單獨(dú)作用于A549細(xì)胞48h后，與陰性對(duì)照相比較，S期細(xì)胞明顯增多62．18%±15．5%vs31．25%±9．1%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。

5 聯(lián)合吉非替尼和5－氟尿嘧啶對(duì)A549細(xì)胞EGFR／p－EGFR的影響 5－氟尿嘧啶（4．8μmol／L）單獨(dú)作用于A549細(xì)胞48h，對(duì)EGFR／p－EGFR表達(dá)無(wú)顯著影響；吉非替尼（5μmol／L）單獨(dú)作用于A549細(xì)胞48h，p－EGFR表達(dá)下調(diào)；聯(lián)合應(yīng)用吉非替尼和5－Fu48h顯著下調(diào)A549細(xì)胞p－EGFR表達(dá)水平，附圖 。

附圖 Western－blot檢測(cè)吉非替尼、5－氟尿嘧啶及聯(lián)合用藥對(duì)A549細(xì)胞EGFR／p－EGFR的影響

討 論

隨著肺癌分子發(fā)病機(jī)制的研究，針對(duì)這些機(jī)制的靶向治療藥物逐漸進(jìn)入臨床，其中EGFR是目前研究最多的肺癌治療靶點(diǎn)。EGFR含有1個(gè)與配體結(jié)合的胞外區(qū)，1個(gè)跨膜區(qū)和1個(gè)具有酪氨酸激酶活性的胞內(nèi)受體區(qū)。當(dāng)表皮生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、雙調(diào)蛋白等配體與EGFR結(jié)合后，進(jìn)行同源或異源二聚化，引起胞內(nèi)酪氨酸殘基自身磷酸化，活化的受體募集信號(hào)復(fù)合體并活化下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，影響細(xì)胞周期和凋亡，參與控制細(xì)胞的存活、血管生成、增殖、細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移等過(guò)程［5～7］。吉非替尼是一種表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑，其通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性地與EGFR酪氨酸激酶催化區(qū)域中的Mg－ATP位點(diǎn)結(jié)合，抑制酪氨酸激酶磷酸化，阻斷EGFR的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而抑制細(xì)胞周期進(jìn)程，加速細(xì)胞凋亡，是最早應(yīng)用于治療非小細(xì)胞肺癌的靶向藥物，與傳統(tǒng)的放化療相比，具有依從性好、不良反應(yīng)少等明顯的優(yōu)點(diǎn)。雖然部分非小細(xì)胞肺癌患者可從中獲益，但不可避免地，此類(lèi)藥物同樣存在耐藥的同題，包括原發(fā)性耐藥和獲得性耐藥。因此如何提高藥物敏感性，克服耐藥已成為目前國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一。

本研究顯示吉非替尼和5－Fu聯(lián)合作用于非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞具有協(xié)同效應(yīng)。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，吉非替尼能夠使S期細(xì)胞比例顯著增多，聯(lián)合應(yīng)用這兩種藥物顯著提高A549細(xì)胞的凋亡，并顯著下調(diào)p－EGFR表達(dá)水平。5－Fu為抗嘧啶類(lèi)抗代謝藥物，在體內(nèi)轉(zhuǎn)變成5－氟尿嘧啶脫氧核苷酸，抑制脫氧胸苷酸合成酶，阻斷脫氧尿苷酸轉(zhuǎn)變成脫氧胸苷酸，從而影響DNA生物，主要作用于S期。因此我們推測(cè)吉非替尼可能通過(guò)增加S期細(xì)胞，下調(diào)p－EGFR表達(dá)水平，提高凋亡率來(lái)增加對(duì)5－Fu的敏感性。A549細(xì)胞為EGFR野生型并含有K－RAS突變，對(duì)EGFR－TKI產(chǎn)生原發(fā)性耐藥。本研究發(fā)現(xiàn)5－Fu能夠增加A549細(xì)胞對(duì)EGFR－TKI的敏感性，該結(jié)果為克服肺腺癌對(duì)EGFRTKI原發(fā)性耐藥提供一種新的治療策略。目前國(guó)外有研究表明，聯(lián)合應(yīng)用吉非替尼和S1作用于T790M突變的肺腺癌細(xì)胞株H1975，具有協(xié)同作用，該細(xì)胞對(duì)EGFR－TKI產(chǎn)生獲得性耐藥，機(jī)制與吉非替尼可以增加胸苷酸合成酶的表達(dá)，提高S1的敏感性有關(guān)［8］。

5－Fu為卡培他濱或S1的體內(nèi)代謝產(chǎn)物，目前這兩種藥物均在進(jìn)行II－III期臨床試驗(yàn)［9］，有望應(yīng)用于非小細(xì)胞肺癌的治療。我們的研究結(jié)果提示吉非替尼與卡培他濱或S1聯(lián)合應(yīng)用在克服吉非替尼原發(fā)性耐藥方面是一種有希望的治療策略。進(jìn)一步可以開(kāi)展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，但是否可真正用于臨床上對(duì)EGFR－TKI靶向藥物治療原發(fā)耐藥的NSCLC的治療，還需要進(jìn)行更多、更深入的研究來(lái)評(píng)估。

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