草蓯蓉多糖提取物誘導(dǎo)人喉癌Hep2細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究

延安大學(xué)附屬醫(yī)院耳鼻喉科二病區(qū) （延安716000） 張 軍 張耀明 王正輝 汪 立

腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素、多步驟和多基因參與的復(fù)雜過(guò)程?；熓侵委熌[瘤一種重要的治療手段，然而目前許多化療作用有限。許多化療藥物被發(fā)現(xiàn)即攻擊腫瘤細(xì)胞，同時(shí)損害人體正常細(xì)胞及免疫系統(tǒng)。因而目前急需找到一種能夠阻止腫瘤生長(zhǎng)并且副作用小的制劑。近些年來(lái)，植物提取物由于其潛在的抗瘤性及低毒性已受到學(xué)者的關(guān)注。草蓯蓉（Boschniakia rossi）又名不老草，為列當(dāng)科草本植物，近年來(lái)文獻(xiàn)報(bào)道，草蓯蓉具有清除自由基、抗脂質(zhì)過(guò)氧化、抗腫瘤、抗炎及增強(qiáng)免疫功能等作用。研究發(fā)現(xiàn)草蓯蓉多糖提取物（BRP）可激活巨噬細(xì)胞活性，并且對(duì)老鼠無(wú)毒性及致畸性［1，2］。因而B(niǎo)RP可能對(duì)腫瘤是一種安全、有效的制劑。本研究首先提取BRP，然后將BRP作用于Hep2細(xì)胞來(lái)研究其對(duì)細(xì)胞的作用及相關(guān)分子機(jī)制。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器 草蓯蓉購(gòu)買自藥店；Hep2細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞中心；卵清蛋白（OVA），MTT，脂多糖（LPS），小牛血清（BSA），二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)買自Sigma；RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自Invitrogen；胎牛血清購(gòu)自四季青公司；pro－caspase－3，pro－caspase－8，pro－caspase－9，DR5，Bcl－2，Bax，βactin抗體購(gòu)自Santa Cruz；培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿為德國(guó)Greiner bio－one公司產(chǎn)品；微孔濾膜為上海亞?wèn)|核級(jí)樹(shù)脂有限公司產(chǎn)品；正置、倒置相差顯微鏡及顯微攝影系統(tǒng)（Nikon）；二氧化碳培養(yǎng)箱，F(xiàn)ACS Calibur流式細(xì)胞儀等。

2 方 法

2．1 多糖制備及分析：將草蓯蓉全草切碎，采用1000ml蒸餾水70～－80度℃過(guò)濾，每次3h除去低分子碳水化合物。用等體積乙酸乙酯萃取，取水層。水層繼續(xù)用等體積正丁醇萃取，正丁醇層經(jīng)減壓蒸餾，原始的多糖放置于DEAE纖維素柱，使用蒸餾水洗脫、高濃度氯化鈉濃縮。采用苯硫酸方法在490nm光度下進(jìn)行低速收集，獲得水溶性成分。水溶性成分使用聚丙烯酰胺葡聚糖200HR層析柱在0．15mmol／L Nacl溶液中，以2ml／min低速進(jìn)行純化，名為多糖成分（BRP）。對(duì)該多糖成分蛋白使用Bradford method進(jìn)行分析。

2．2 細(xì)胞培養(yǎng)：Hep2細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于10%FCS RPMI 1640培養(yǎng)基，常規(guī)加50U／ml青霉素，50U／ml鏈霉素。置于37℃、CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，每周傳代2次。

2．3 細(xì)胞活性測(cè)定：Hep2細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，培養(yǎng)于含10%滅活小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，置37℃、相對(duì)濕度5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hep2細(xì)胞按每孔1×105個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，每孔體積200μl。待細(xì)胞貼壁后，藥物組加入藥物使其終濃度分別為50、100、200μg／ml和400μg／ml，另設(shè)不加藥物的陰性對(duì)照組以及不接種細(xì)胞的空白對(duì)照組。分別培養(yǎng)24h，每個(gè)濃度每個(gè)時(shí)點(diǎn)均設(shè)4個(gè)復(fù)孔。于終止前4h，每孔加入5g／L MTT溶液20μl，繼續(xù)孵育4 h后棄去上清液，加入150μl DMSO，輕輕振蕩10 min，使結(jié)晶物完全溶解，于490nm波長(zhǎng)處在酶聯(lián)分析儀上測(cè)光吸收值（A值），計(jì)算生長(zhǎng)抑制率［3］。抑制率（%）＝（對(duì)照組A值－實(shí)驗(yàn)組A值）／對(duì)照組A值×100。

2．4 細(xì)胞周期分析：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hep2細(xì)胞按每孔1×106細(xì)胞接種于6孔板中，每孔2ml。待細(xì)胞貼壁后，藥物組加入藥物使其終濃度為200μg／ml，另設(shè)不加藥物的陰性對(duì)照組以及不接種細(xì)胞的空白對(duì)照組。繼續(xù)作用細(xì)胞24h后，收集細(xì)胞懸液。棄掉培養(yǎng)液，70%冷乙醇固定，4℃PI和RNaseA酶暗染30 min，用流式細(xì)胞儀對(duì)各組樣本進(jìn)行DNA含量及細(xì)胞周期分析。

2．5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hep2細(xì)胞按每孔1×106細(xì)胞接種于6孔板中，細(xì)胞密度達(dá)到30%～50%時(shí)，將不同濃度藥物作用于細(xì)胞，培養(yǎng)24h后收集細(xì)胞。離心后去除上清液，冰預(yù)冷PBS洗細(xì)胞2次，保證每管細(xì)胞數(shù)至少106個(gè)。加入5μl Annexin V－FITC和2．5μl PI到另一個(gè)試管中，再加入100μl細(xì)胞懸液，混勻后室溫孵育10～15min。加入400μl 1×binding buffer混勻后30min內(nèi)上機(jī)。測(cè)定每個(gè)上機(jī)樣管數(shù)據(jù)，采用Cell Quest軟件進(jìn)行參數(shù)獲取和分析，計(jì)算凋亡細(xì)胞百分比。

2．6 Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白：轉(zhuǎn)染后48h，加入單去污細(xì)胞裂解液，在4℃以12000×g離心3min，取上清，用Lowry法定量蛋白，經(jīng)聚丙烯酰胺變性凝膠電泳分離蛋白，用電轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)置PVDF膜上，依次加入封閉液、pro－caspase－3，pro－caspase－8，procaspase－9，DR5，Bcl－2，Bax，β－actin抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗，再經(jīng)化學(xué)發(fā)光劑反應(yīng)，X光片壓片曝光。使用GEL DOC 2000system分析軟件對(duì)條帶進(jìn)行分析。

2．7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：以上方法均各取3個(gè)樣本，每個(gè)樣本重復(fù)3次。采用SPSS 10．0軟件包，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行配對(duì)tq檢驗(yàn)和組間方差分析。

結(jié) 果

1 BRP化學(xué)成分分析 采用乙醇提取法獲得水溶性的粗多糖成分。然后經(jīng)過(guò)DEAE層析柱、Sephacryl S－200HR滲透獲得純化的多糖，高通量色譜分析儀結(jié)果發(fā)現(xiàn)BRP為單個(gè)、尖銳的峰，顯示出提純的BRP單一性。根據(jù)分子量檢測(cè)顯示BRP大約為22kDa，純度為96．9%。Bradford法檢測(cè)結(jié)果為陰性，提示BRP內(nèi)無(wú)蛋白及核酸成分。

2 BRP對(duì)Hep2細(xì)胞活性的影響 與對(duì)照組相比，不同濃度的BRP對(duì)細(xì)胞活性呈時(shí)間、濃度依賴性抑制。作用72h后，400μg／ml的BRP對(duì)細(xì)胞活性抑制率最高達(dá)到87．57%，而50μg／ml的BRP在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)細(xì)胞活性抑制率與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異（P＞0．05）。因此后續(xù)檢測(cè)選用100，200和400μg／ml三個(gè)濃度進(jìn)行檢測(cè)，見(jiàn)附表。

附表 MTT法檢測(cè)不同濃度BRP對(duì)細(xì)胞活性的影響

3 BRP對(duì)細(xì)胞周期的影響 流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示，空白對(duì)照組細(xì)胞G0／G1，S和G2／M期細(xì)胞比率分別為22．4%，59．4% 和19．3% 。而200μg／ml BRP作用24h后，G0／G1期細(xì)胞比率顯著上升，多數(shù)細(xì)胞阻滯在G0／G1期，比率達(dá)到67．6%。同時(shí)伴隨著S期細(xì)胞比率達(dá)到23．6%。

4 BRP對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 采用annexin－V／PI染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，不同濃度的BRP（100，200，400μg／ml）作用24h后，各組細(xì)胞凋亡比率明顯增加，分別是23．44%，43．86%，53．67%。這些結(jié)果提示BRP可能主要通過(guò)誘導(dǎo)Hep2細(xì)胞凋亡來(lái)抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)。

5 凋亡途徑分析 采用 Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)途徑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，隨著濃度的增加，BRP 明 顯 抑 制 pro－caspase－3、pro－caspase－8、procaspase－9的表達(dá)，說(shuō)明 pro－caspase－3、pro－caspase－8、pro－caspase－9分裂增加，同時(shí)可明顯抑制 Bcl－2的表達(dá)。而死亡受體DR5、Bax的表達(dá)則明顯增加。

討 論

喉鱗狀細(xì)胞癌是人體頭頸部高發(fā)和高病死率的腫瘤，占到頭頸部腫瘤的90%左右，其常規(guī)治療方法是外科手術(shù)和放療。盡管許多研究發(fā)現(xiàn)，系統(tǒng)性的化療對(duì)鱗癌有效，然而其手術(shù)和術(shù)后化療5年生存率仍較低［4］。故采用新化療藥物并研究新化療方案，以提高療效、減低化療毒性、增強(qiáng)耐受性成為研究的熱點(diǎn)。

目前研究發(fā)現(xiàn)一些傳統(tǒng)的中藥對(duì)許多腫瘤包括鱗癌有效，并且毒副作用小。這些中藥主要通過(guò)刺激巨噬細(xì)胞及調(diào)節(jié)人體補(bǔ)體系統(tǒng)來(lái)抑制腫瘤的生長(zhǎng)［5，6］。研究發(fā)現(xiàn)草蓯蓉提取物具有多方面的藥理活性，而這多重的藥理作用決定了它的用途。研究發(fā)現(xiàn)草蓯蓉提取物具有抗腫瘤和清除自由基作用。王秋燕等研究發(fā)現(xiàn)草蓯蓉可抑制小鼠肝癌的生長(zhǎng)［7］，并可激活小鼠的免疫系統(tǒng)［8］。因此本研究采用草蓯蓉提取物BRP作用于Hep2細(xì)胞，觀察其對(duì)細(xì)胞的影響，研究發(fā)現(xiàn)不同濃度的BRP可明顯抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)，并使細(xì)胞周期發(fā)生變化，通過(guò)流式細(xì)胞儀分析發(fā)現(xiàn)BRP作用后細(xì)胞凋亡明顯增加，說(shuō)明BRP主要通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)抑制Hep2細(xì)胞的生長(zhǎng)。

細(xì)胞凋亡的過(guò)程是程序化的、多基因調(diào)控的。與細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因大致有bcl－2家族、p53、fas、cmyc、k－ras等，細(xì)胞是否進(jìn)入凋亡通道取決于這些凋亡相關(guān)基因的綜合調(diào)控結(jié)果［9］。目前研究發(fā)現(xiàn)參與細(xì)胞凋亡主要有兩個(gè)途徑：外部死亡受體途徑與內(nèi)部線粒體途徑。兩條途徑交匯于capase基因的激活，而這一基因在誘導(dǎo)過(guò)程中起關(guān)鍵的調(diào)控作用。為了研究BRP誘導(dǎo)Hep2細(xì)胞凋亡的分子途徑，本研究采用western blot檢測(cè)分析相關(guān)蛋白。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同濃度BRP作用于細(xì)胞后，capase－3、capase－8和capase－9的表達(dá)呈濃度性增加，而這些蛋白的變化表明外部途徑與線粒體途徑都被激活。而死亡受體DR5表達(dá)的增強(qiáng)表明外部途徑的參與。Bcl－2家族是參與細(xì)胞生存或凋亡的重要調(diào)節(jié)蛋白，與線粒體途徑密切相關(guān)。其家族成員具備雙重功能，其中Bcl－2、Bcl－xl等抑制細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生，而B(niǎo)ax、Bcl－xs等促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)BRP作用后Bcl－2表達(dá)減少，Bax表達(dá)增加，這些結(jié)果表明BRP激活Hep2細(xì)胞線粒體凋亡途徑主要通過(guò)激活Bcl－2家族來(lái)實(shí)現(xiàn)。

通過(guò)實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)草蓯蓉多糖提取物BRP通過(guò)使細(xì)胞周期變化，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可明顯抑制人喉癌Hep2細(xì)胞的增殖，其凋亡機(jī)制為外部死亡受體和內(nèi)部線粒體途徑共同參與凋亡的發(fā)生。這些為研制新的化療藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，深入研究BRP對(duì)喉癌細(xì)胞的作用機(jī)制可能為治療鱗癌或其它腫瘤提供新的思路。

［1］ Fei R，Chi LC，Du JS，et al ．Toxicity of polysaccharides of Boschniakia rossica［J］．Northeast Normal Univ，2008，40：98－100．

［2］ Chihara G．Recent progress in immunopharmacology and therapeutic effects of polysaccharides［J］．Dev Biol Stand，1992，77：191－197．

［3］ 李發(fā)萍，曹 華，吳玉瑛，RNA干擾Jab1基因?qū)θ撕眵[狀細(xì)胞癌Hep2細(xì)胞增殖影響［J］．中國(guó)耳鼻咽喉頭頸外科，2011，18（9）：465－468．

［4］ 張健梅，文 姝，李 杰，等．三氧化二砷與紫杉醇聯(lián)合誘導(dǎo)Hep2細(xì)胞凋亡的體外研究［J］．中國(guó)耳鼻咽喉頭頸外科，2011，18（4）：196－199．

［5］ Wang SY，Hsu ML，Hsu HC，et al．The antitumor effect of Ganoderma lucidum is mediated by cytokines released from activated macrophages and T lymphocytes［J］．Int J Cancer，1997，70：699－705．

［6］ Wasser S．Medicinalmushrooms as a source of antitumor and immunomodulating polysaccharides［J］．Appl Microbiol Biotechnol，2003，60：258－274．

［7］ 王秋燕，王 晶，倪 穎，等．草蓯蓉水萃取物對(duì)小鼠肝癌移植瘤的生長(zhǎng)抑制作用［J］．延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)學(xué)報(bào)，2012，35（2）：107－109．

［8］ 金愛(ài)花，樸龍，尹學(xué)哲，全吉淑．草蓯蓉環(huán)烯醚萜苷對(duì)H22小鼠肝癌移植瘤的抑瘤作用［J］．中草藥，2012，43（2）：332－335．

［9］ Lu QL，Poulsom R，Wong L，et al．Bcl－2expression in adult and embryonic non－h(huán)aematopoietic tissues［J］．J Pathol，1993，169（4）：431－437．