高效液相色譜法測定奶粉中雙氰胺質量濃度

周元元，楊嘉，盧偉，張鵬，朱姜，王帥

（揚州市產(chǎn)品質量監(jiān)督檢驗所，江蘇 揚州 225000）

0 引 言

雙氰胺，又名二聚氰胺，二氰二胺。新西蘭的部分農(nóng)場將其用作硝化抑制劑，其目的是為了降低水中硝酸鹽質量分數(shù)和減少溫室氣體排放，但是通過食物鏈的傳遞，雙氰胺會到達奶粉中，最終進入人體中。新西蘭檢測了近2000個奶粉樣品，有371個樣品中檢出雙氰胺。在我國消費者對乳制品的安全特別重視和關注，因此有必要對奶粉中的雙氰胺進行監(jiān)測。

目前奶粉中雙氰胺的檢測方法主要是液相色譜-質譜法[1-2]，同時還有其他食品、藥品、空氣中雙氰胺的檢測報道，主要是液相色譜法和液相色譜-質譜法[3-6]。液質儀器價格昂貴，操作專業(yè)要求高，因此普及率不高。樣品基質的差異使上述文獻中的前處理方法無法滿足奶粉樣品的檢測。本文通過對提取溶劑和色譜分離條件的優(yōu)化，建立了高效液相色譜測定奶粉中雙氰胺質量濃度的方法。

1 實 驗

1.1 材料與試劑

雙氰胺標準品（純度99%），0.22 μm針式微孔濾膜過濾器，甲醇、乙醇、乙腈為色譜純，乙酸鋅、亞鐵氰化鉀、三氯乙酸、氨水均為國產(chǎn)分析純，實驗用水符合GB/T 6682一級水要求。

1.2 儀器與設備

Agilent 1200高效液相色譜儀（配有二極管陣列檢測器），渦旋混合器，Milli-Q Academic超純水機，Sartorius CP225D型電子天平，SIGMA 3K15高速離心機，KQ-250E型超聲波清洗器。

1.3 色譜條件

色譜柱：Shodex Asahipak NH2P-50 4E氨基柱（4.6mm×250mm，5 μm）；柱溫為40 ℃；進樣量為10 μL；流動相：乙腈-水 (70∶30，體積比)，其中每100 mL水中添加25%氨水0.2 mL；流速為1.0 mL/min；檢測波長為218 nm。

1.4 標準溶液的配制

準確稱取適量雙氰胺標準品，用甲醇溶解得到質量濃度為500 mg/L的標準儲備液，用甲醇稀釋標準儲備液， 配制成質量濃度為0.008，0.02，0.08，0.4，2.0，4.0 mg/L的標準使用液，繪制標準曲線，確定線性范圍。

1.5 樣品處理

稱取2 g均勻樣品(準確至0.001 g)，置于50 mL具塞刻度試管中，加水10 mL，充分溶解后加入質量分數(shù)為1%三氯乙酸水溶液定容至滿刻度，超聲5 min后靜置20 min,上清液經(jīng)0.22 μm 水系濾膜過濾，供HPLC分析。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 色譜柱的選擇

雙氰胺的極性較強，C18柱對其沒有保留，需要使用離子對試劑，而后者對色譜柱有一定的傷害，并且檢測重復性和重現(xiàn)性較差。氨基柱能用于分離極性較大的物質，根據(jù)雙氰胺的性質，本實驗選擇了氨基柱作為分析色譜柱。

2.1.2 檢測波長的選擇

取質量濃度為2 mg/L的雙氰胺標準使用液及待檢樣品處理液，在190～400 nm波長處進行掃描，發(fā)現(xiàn)雙氰胺在218 nm處有較大吸收峰(圖1)，且樣品處理液雜峰少，因此選擇218 nm作為檢測波長。測定中采用了二極管陣列檢測器對其進行光譜掃描，結合保留時間和掃描光譜圖相似性進行定性。

圖1 雙氰胺光譜

2.1.3 流動相的選擇

嘗試了反相色譜分析中氨基色譜柱常用流動相乙腈和水的不同配比，結合標樣色譜圖峰型和樣品處理液的分離效果 （圖2和圖3），確定了最佳的流動相條件。

2.2 提取方法的優(yōu)化

圖2 雙氰胺標樣色譜

圖3 雙氰胺奶粉樣品色譜

參照雙氰胺的溶解性，選擇了甲醇、乙醇、乙腈、1%三氯乙酸作為提取試劑定容，并配合兩種沉淀方法：（1）加水溶解樣品后加入1.5 mL質量分數(shù)為10%亞鐵氰化鉀和1.5 mL質量分數(shù)為20%乙酸鋅；（2）加水溶解樣品后加入2 mL質量分數(shù)為20%乙酸鉛，進行提取條件的優(yōu)化。經(jīng)過反復試驗和加標回收試驗發(fā)現(xiàn)不使用沉淀劑，直接用甲醇或質量分數(shù)1%三氯乙酸定容、振蕩提取效果較好，且兩種方法加標回收率差異不顯著?？紤]到質量分數(shù)1%三氯乙酸水溶液減少了有機試劑的使用，降低了實驗人員與有機試劑的接觸機會，對環(huán)境更加友好，因此選擇1%三氯乙酸水溶液作為提取溶劑。

2.3 線性范圍和檢出限

參照“1.4”配制雙氰胺標準使用液，按“2.1”色譜條件進行測定，以質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制曲線，在質量濃度為0.008～4.0 mg/L范圍內，標準品的質量濃度與峰面積值具有良好的線性關系（圖4），回歸方程y=90.59x+2.7451，r=0.9998。將已知濃度標準品溶液不斷稀釋，當S/N為3時，最低儀器檢出限為1 μg/L，方法的定量下限為0.08 mg/kg。

圖4 雙氰胺標準曲線

2.4 回收率和精密度

準確稱取陰性對照奶粉進行加標實驗，計算回收率和精密度。分別進行三水平加標測試，每個水平測定6次，計算回收率和相對標準偏差，結果如表1所示。由表1可以看出，不同添加水平下，回收率范圍為84.7%～103.2%，相對標準偏差在2.29%～3.48%之間，完全可以滿足日常分析的要求。

表1 加標回收率及精密度實驗結果

3 結 論

本文建立了高效液相色譜法測定奶粉中雙氰胺質量濃度的檢測方法，方法精密度、回收率和檢出限能滿足實際樣品檢測的需要。樣品前處理過程簡單，不使用有機溶劑，無復雜的凈化步驟，降低檢測成本的同時也降低了檢驗人員的健康風險，對環(huán)境更加友好。二極管陣列檢測器的使用降低了實驗室檢測的門檻，易于推廣和應用，便于基層食品監(jiān)管機構及時有效地對奶粉安全進行監(jiān)控。

[1]黃芳，馬葉芬，吳惠勤，等.液相色譜-串聯(lián)質譜法快速測定奶粉中的雙氰胺[J].分析測試學報，2013,32(3):271-274.

[2]許嬌嬌,張京順,黃百芬，等.液相色譜-串聯(lián)質譜同位素稀釋法測定奶粉中雙氰胺的殘留[J].食品安全質量檢測學報，2013,4(2):415-420.

[3]王祖翔，蔣俊，孫莉，等.高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定食品中的尿素_縮二脲與雙氰胺[J].分析測試學報，2012,31(5):593-599.

[4]馬玉榮,張茹 ,秦莉偉.HPLC測定復方鹽酸二甲雙胍格列苯脲中3種有關物質[J].中國藥事，2009,23(9):911-913.

[5]吳莉,石蓓佳,王玉.反相離子對HPLC法測定鹽酸二甲雙胍中雙氰胺的含量[J].中國生化藥物雜志，2009,30(2):110-113.

[6]周靖平,倉公敖.工作場所空氣中雙氰胺的高效液相色譜法測定[J].中國職業(yè)醫(yī)學，2009,36(2):151-153.