膠體金法定性檢測牛奶中林可霉素的應用

李利芬，楊國輝，趙文君，劉玉茹，張淑麗，姚升峰

（內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)科爾沁有限責任公司，內(nèi)蒙古通遼028000）

0 引言

林可霉素類藥物是由鏈霉菌產(chǎn)生的林可酰胺類抗生素。它是一種強效、窄譜的抑菌性抗生素。林可霉素殘留通過食物鏈進入人體后累積可以導致細菌耐藥性，因此，各國都對其作出限量要求，中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第235號-2002動物性食品中獸藥最高殘留限量100 ng/mL。林可霉素殘留量的常規(guī)檢測方法主要有高效液相色譜技術(shù)[1]、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜[2]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC－MS／MS）[3]、氮磷氣相色譜檢測法[4]、薄層色譜[5]、氣相色譜[6]等，由于復雜的儀器設備和繁瑣的過程以及對檢驗人員的高技能要求，不適合現(xiàn)場監(jiān)控大量樣本的篩查。本文的目的就是介紹快速靈敏地檢測牛奶中林可霉素殘留的方法--膠體金免疫層析法，測該方法為定性檢測，并可用兩種方法進行檢測：方法一林可霉素檢出限40 ng/mL，方法二林可霉素檢出限100 ng/mL。

1 實驗

1.1 材料和設備

鮮奶樣，12%復原乳，生乳脂肪層的奶樣。

試劑：雙氧水，碳酸氫鈉，青霉素，糊精，三聚氰胺，氯化銨，北京勤邦林可霉素快速檢測試紙條。

儀器為德國普蘭德（BRAND）公司制造的移液器。

2 方法

2.1 干擾物質(zhì)的配制備

分別取不含目標檢測物質(zhì)與含目標檢測物質(zhì)的生乳做本底，分別制備出質(zhì)量濃度為20 mg/L雙氧水摻假樣品、質(zhì)量分數(shù)為0.1%碳酸氫鈉摻假樣品、100 μg/kg青霉素抗生素摻假樣品、0.2%糊精摻假樣品、0.1%三聚氰胺摻假樣品、0.1%銨鹽摻假樣品。

2.2 具體檢測步驟

（1）使用前將本膠體金免疫層析試紙條和待檢牛奶樣本回復至室溫。

（2）從原包裝中取出試劑桶，打開后取出所需數(shù)目的微孔試劑和試紙條，并做好標記，在60 min內(nèi)盡快使用。檢測試劑取出后，請立即蓋好試劑桶蓋，防止受潮。

（3）方法一：用微量移液器吸取200 μL待檢樣本于微孔中，緩慢抽吸且充分與微孔中試劑混勻；方法二：用微量移液器吸取150 μL樣本稀釋液和50 μL待檢樣本于微孔中，緩慢抽吸且充分與微孔中試劑混勻。

（4）將標記好的試紙條插入微孔中——印有“MAX”線端朝下，使之充分浸入溶液中。

（5）室溫（20～25 ℃）孵育5 min 后，取出試紙條判定結(jié)果，其他時間判定無效。

2.3 結(jié)果判定

（1）陰性（-）：C線顯色，T線顯色，無論顏色深淺，均表示牛奶樣品中林可霉素濃度低于檢測限。

（2）陽性（+）：C線顯色，T線不顯色，表示牛奶樣品中林可霉素濃度高于檢測限。

（3）無效：未出現(xiàn)C線，表明不正確的操作過程或試紙條已變質(zhì)失效。

3 結(jié)果與分析

3.1 檢出限實驗

對生乳樣品本底、檢出限點及檢出限附近點進行檢測，每個點進行平行樣檢測，檢測結(jié)果如表1所示。

表1 林可霉素快速檢測試紙條檢出限實驗對比結(jié)果 ng/mL

3.2 重復性實驗

使用方法一、方法二對原奶樣本進行檢測，檢測點質(zhì)量濃度為生乳（空白實驗）、50 ng/mL，100 ng/mL每個點做10平行，符合率為100%。

3.3 干擾實驗

3.3.1 陰性干擾

取不含目標檢測物質(zhì)的生乳做本底，加入如下干擾物質(zhì)檢測，檢測情況如表2所示。

表2 林可霉素快速檢測試紙條陰性抗干擾性能對比結(jié)果

3.3.2 陽性干擾

取含目標檢測物質(zhì)的樣品（生乳）做本底，方法一加標質(zhì)量濃度為50 ng/mL，方法二加標質(zhì)量濃度為100 ng/mL，在制備的陽性樣本中加入如下干擾物質(zhì)，檢測結(jié)果如表3所示。

3.4 批量檢驗結(jié)果

連續(xù)15日使用林可霉素試紙條對生乳樣品進行檢測，每天檢測20個生乳樣品，檢測過程中所用林可霉素試紙條未出現(xiàn)失效、不走線等不良情況。

4 結(jié) 論

由上述可以看出，林可霉素定性檢測膠體金免疫層析法具有以下優(yōu)點：

表3 林可霉素快速檢測試紙條陽性抗干擾性能對比結(jié)果

（1）在檢測過程中無需前處理，直接檢測，操作簡便；

（2）整個檢測過程用時6～7min，用時短；

（3）對陰性生乳、陽性加標樣品分別做了10次重復性檢測，檢測結(jié)果相同，重復性好；

（4）分別對陰性生乳、陽性加標樣品做了8類物質(zhì)的抗干擾實驗，檢測結(jié)果一致，抗干擾能力強。

綜上所述，采用膠體金免疫層析方法，在NC膜上預包被偶聯(lián)抗原，樣品中的林可霉素和NC膜上預包被的偶聯(lián)抗原競爭抗林可霉素抗體，抑制抗原和抗林可霉素抗體的結(jié)合，對牛奶樣品中林可霉素做快速定性篩選。運用此方法對生乳中林可霉素殘留量進行篩選，與高效液相色譜技術(shù)、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC－MS/MS）、氮磷氣相色譜檢測法、薄層色譜、氣相色譜的檢測技術(shù)相比上述方法由于復雜的儀器設備和繁瑣的過程以及對檢驗人員的高技能要求，不適合現(xiàn)場監(jiān)控大量樣本的篩查，而此法樣本前處理簡單、儀器設備投資少，檢測成本低，可作為林可霉素藥物殘留快速篩選的首選方法。對于乳品企業(yè)，此法能夠保障到廠原奶及時出具檢測結(jié)果，且能夠滿足對到廠生乳及定容奶倉的定性篩選排查，可將儀器法作為此法的確認法。

[1]錢紅薈，曹敏，高效液相色譜法同時檢測鹽酸林可霉素和硝酸咪康唑[J].海峽藥學，2008（4）：36－38.

[2]岳振峰，陳小霞，謝麗琪，等.高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定動物組織中林可酰胺類和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素殘留[J].分析化學，2007，35（9）：1290－1294.

[3]GB/T 22941－2008，蜂蜜中林可霉素紅霉素螺旋霉素替米考星泰樂霉素交沙霉素吉他霉素竹桃霉素殘留量的測定液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法[G].

[4]LUO W，YIN B，ANG C Y，et al.Determination of lincomycin residues in salmon tissues by gas chromatography with nitrogen－phosphorus detection[J].Journal of Chromatography B：Biomedical Sciences and Applications，1996，687（2）：405－411.

[5]王鑫芳，劉穎，李明江，等.用薄層色譜法檢測林可霉素B組分[J].中國生化藥物雜志，2006，27（6）：371－371，382.

[6]陶燕飛，于剛，陳冬梅，等.動物可食性組織中林可霉素和大觀霉素殘留檢測方法——氣相色譜法[J].中國農(nóng)業(yè)科技導報，2008，10（S2）：63－68.