乳用動(dòng)物乳腺特異性miRNAs研究進(jìn)展

曲波，王春梅，仇有文，袁肖寒，甄貞，姜毓君

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)a.乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，b.生命科學(xué)與生物技術(shù)研究中心，哈爾濱150030）

0 引言

2008年12月，農(nóng)業(yè)部發(fā)布的《乳用動(dòng)物健康標(biāo)準(zhǔn)》中指出：“乳用動(dòng)物是指用于生產(chǎn)供人類食用或加工用生鮮乳的奶牛、奶山羊等動(dòng)物”。乳腺是乳用動(dòng)物的生產(chǎn)器官，可以將營(yíng)養(yǎng)素轉(zhuǎn)化為乳成分并形成乳汁。乳腺的發(fā)育涉及眾多激素和細(xì)胞因子參與。miRNAs（microRNAs）是一種廣泛存在的、對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行微調(diào)的分子，大量研究證實(shí)，miRNAs參與乳腺發(fā)育、泌乳和退化過程的諸多調(diào)節(jié)途徑[1-2]。

目前，有關(guān)miRNAs在乳腺發(fā)育和泌乳活動(dòng)中作用和機(jī)制的研究還主要集中在人和小鼠等模式生物上，雖然與乳用動(dòng)物乳腺特異性miRNAs有關(guān)的報(bào)道并不多，但相關(guān)的研究正逐漸成為乳腺發(fā)育與泌乳生物學(xué)研究的熱點(diǎn)[3]。本文就近年來奶牛與奶山羊乳腺miRNAs研究工作做一概述，為未來此領(lǐng)域的研究提供依據(jù)。

1 miRNAs與乳腺生物學(xué)

1.1 miRNAs 的預(yù)測(cè)與鑒定

miRNA（microRNA）是一類長(zhǎng)約22 nt的內(nèi)源非編碼小分子RNA，由長(zhǎng)約70 nt的發(fā)夾狀前體RNA（pre-miRNA）加工而成。已有研究證實(shí)，miRNAs在轉(zhuǎn)錄后水平迅速靈敏地調(diào)節(jié)著基因的表達(dá)，廣泛參與細(xì)胞發(fā)育、分化、增殖、凋亡、代謝、腫瘤轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)過程[4]。

雖然miRNAs的研究歷史很短，但其進(jìn)展勢(shì)頭十分迅猛，迄今miRBase收錄的miRNAs已超過3萬(wàn)條。近年來，隨著miRNAs研究的深入，各種miRNAs檢測(cè)技術(shù)也是層出不窮，但主要還是分為3類。一是傳統(tǒng)的克隆方法，這也是最早被應(yīng)用于檢測(cè)miRNAs領(lǐng)域的方法之一；二是新一代測(cè)序技術(shù)（next-generation sequencing，NGS），實(shí)現(xiàn)了高通量篩選新的miRNAs；最后是生物信息學(xué)方法，該法最具效率，應(yīng)用最廣，為NGS的高通量篩選提供技術(shù)保證，已成為尋找和鑒定miRNAs及靶基因的主要方法[5]。隨著人們對(duì)miRNAs及其靶基因性質(zhì)和特點(diǎn)的深入了解，以及物種基因組信息的完善，相信會(huì)有更多的miRNAs和靶基因被發(fā)現(xiàn)。

1.2 miRNAs在乳腺發(fā)育中的作用與機(jī)制

乳腺作為具有泌乳功能的哺乳動(dòng)物特有器官，在其生長(zhǎng)發(fā)育過程中經(jīng)歷著細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、增殖、凋亡等生命過程。哺乳動(dòng)物生殖周期中乳腺的功能性分化是至關(guān)重要的。乳腺發(fā)育和泌乳活動(dòng)都是通過神經(jīng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)節(jié)。此外，激素和生長(zhǎng)因子在乳腺不同階段的發(fā)育過程中起重要作用。miRNAs作為廣泛存在的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制，主要靶向于信號(hào)分子、結(jié)點(diǎn)蛋白及信號(hào)蛋白，可能對(duì)傳統(tǒng)的神經(jīng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)細(xì)胞因子水平調(diào)節(jié)引入新的調(diào)控機(jī)制。隨著miRNAs的不斷發(fā)現(xiàn)和深入探索，有關(guān)miRNAs對(duì)乳腺發(fā)育和泌乳功能調(diào)控的研究也逐步展開。

Sdassi等人應(yīng)用克隆方法在乳腺中發(fā)現(xiàn)了24個(gè)乳腺發(fā)育的相關(guān)miRNAs基因并鑒定了其中6個(gè)，發(fā)現(xiàn)它們有一定的組織特異性[6]。李曄等發(fā)現(xiàn)，miR-195和miR-365對(duì)小鼠乳腺上皮細(xì)胞活性及增殖能力有抑制作用，還可降低小鼠乳腺上皮細(xì)胞乳糖分泌，抑制乳腺上皮細(xì)胞的泌乳能力[7]。李慧銘等應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法結(jié)合生物信息學(xué)、熒光定量PCR等技術(shù)證明，miR-142-3p對(duì)小鼠乳腺上皮細(xì)胞活性及增殖能力有抑制作用，對(duì)小鼠乳腺上皮細(xì)胞中酪蛋白和甘油三酯的合成分泌有抑制作用，其靶基因?yàn)镻RLR[8]。

乳腺組織特異性miRNs的陸續(xù)發(fā)現(xiàn)及其相關(guān)靶基因的確定，初步揭示了其在乳腺發(fā)育和泌乳機(jī)能分化中的調(diào)控作用，而且其調(diào)控作用可能是一種調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，但目前miRNAs調(diào)控哪些細(xì)胞因子、哪些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，它們與信號(hào)分子的關(guān)系如何等問題，都亟待去揭示和探討。

2 乳用動(dòng)物乳腺miRNAs的篩選與鑒定

2.1 奶牛乳腺miRNAs的篩選與鑒定

2009年，牛全基因組測(cè)序完成后，與奶牛健康、疾病、乳品質(zhì)相關(guān)的功能基因研究逐漸成為熱點(diǎn)，有關(guān)奶牛乳腺miRNAs的研究也較其他反芻動(dòng)物多[9]。

早在2007年，Gu等就通過克隆的方法從牛乳腺和脂肪組織中鑒定出59個(gè)不同的miRNAs。其中miR-21、miR-23a、miR-24和miR-143在奶牛乳腺組織中大量表達(dá)[10]。

相對(duì)于傳統(tǒng)克隆方法的費(fèi)時(shí)費(fèi)力，高效、快速的大規(guī)模測(cè)序技術(shù)逐漸應(yīng)用到奶牛乳腺miRNAs的篩選上來。2012年，李真等以泌乳期和非泌乳期奶牛為對(duì)象，采用Solexa高通量測(cè)序技術(shù)共獲得884個(gè)奶牛乳腺miRNAs序列，其中已知序列283條，保守序列96條，新發(fā)現(xiàn)序列505條，同時(shí)獲得兩個(gè)時(shí)期miRNA的差異表達(dá)譜。在檢測(cè)到的69條差異miRNAs中，有45條miRNA在泌乳期表達(dá)顯著下調(diào)，表明miRNA在奶牛泌乳過程中存在重要的調(diào)控作用[11-12]。

值得注意的是，自Weber等于人母乳中篩選檢測(cè)到miRNAs以來，人母乳中已檢測(cè)到多種miRNAs[13]。近年來，有報(bào)道指出牛乳中也含有miRNAs。2012年，Izumi等通過基因芯片分別檢測(cè)健康荷斯坦牛初乳與常乳，結(jié)果共檢測(cè)到102個(gè)miRNAs，其中初乳中有100個(gè)，常乳中含53個(gè)，有51個(gè)miRNAs在初乳與常乳中都存在。該團(tuán)隊(duì)還篩選出一些與免疫和發(fā)育密切相關(guān)的miRNAs進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證，包括miR-15b、miR-27b、miR-34a、miR-106b、miR-130a、miR-155和miR-223等，結(jié)果全部為陽(yáng)性，而且初乳中的表達(dá)水平顯著高于常乳，暗示這些miRNAs與器官發(fā)育和免疫功能調(diào)節(jié)有關(guān)[14]。

2.2 奶山羊乳腺miRNAs的篩選與鑒定

山羊是最早被人類馴化的動(dòng)物之一，但其基因組測(cè)序工作卻遠(yuǎn)落后于其他家畜，這也使山羊miRNAs的研究工作極大受限。直到2012年底，山羊的基因組序列組裝才初步完成，該研究整合使用了NGS和最新的DNA單分子光學(xué)作圖技術(shù)，成功克服了山羊基因組的組裝難題，提供了首個(gè)小型反芻動(dòng)物參考基因組[15]。盡管山羊基因組序列信息仍不完整，但隨著高通量技術(shù)的運(yùn)用和生物信息學(xué)的迅猛發(fā)展，有關(guān)山羊乳腺miRNAs的挖掘工作還是逐步開展起來[4,16]。

2012年，Ji等以嶗山奶山羊不同發(fā)育時(shí)期乳腺為研究材料，分別構(gòu)建了泌乳初期、泌乳高峰期、泌乳末期三個(gè)miRNA文庫(kù)，并用Solexa高通量技術(shù)進(jìn)行測(cè)序、篩選，結(jié)果在乳腺組織中獲得已知miRNAs 336個(gè)，新miRNAs 50個(gè)，顯著差異表達(dá)miRNAs 189個(gè)，表 達(dá) 豐 度 最 高 的 包 括 let-7a、let-7b、miR-143、miR-378、miR-148a等。通過進(jìn)一步的生物信息學(xué)分析共獲得68條顯著富集的信號(hào)通路，且均富集到了MAPK、Wnt、Insulin、Jak-STAT等與泌乳有關(guān)的信號(hào)通路上[17-19]。隨后，Dong等通過生物信息學(xué)方法對(duì)其中一些差異顯著的miRNAs進(jìn)行了靶基因預(yù)測(cè)與分析，結(jié)果獲得了22個(gè)miRNAs的215個(gè)靶基因，預(yù)示著它們?cè)谀躺窖蛉橄侔l(fā)育過程中具有重要的調(diào)控功能，如與乳成分合成與運(yùn)輸密切相關(guān)的miR-378、miR-423-5p和miR-7等[20]。同年，Li等對(duì)西農(nóng)薩能奶山羊干奶期和泌乳高峰期乳腺組織miRNAs轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了比較研究，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的miRNAs中包括346個(gè)保守的miRNAs和95個(gè)新miRNAs，其中表達(dá)差 異 較 高 有 miR-288、miR-199a、miR-451、miR-98、miR-247、miR-25、miR-199b、miR-128、miR-145、miR-222、miR-181b等[21]。

此外，還有一些研究團(tuán)隊(duì)著眼于山羊睪丸、肌肉等特異miRNAs的鑒定工作，也都取得了較好的結(jié)果。

3 miRNAs對(duì)乳用動(dòng)物乳腺發(fā)育和泌乳的影響

3.1 miRNAs對(duì)奶牛乳腺發(fā)育和泌乳的影響

奶牛乳腺發(fā)育與泌乳是一個(gè)復(fù)雜的過程，受到眾多調(diào)節(jié)因素的支配。近年來，miRNAs的調(diào)控作用越來越受到關(guān)注[22]。

大量研究證實(shí)miRNAs對(duì)奶牛乳腺發(fā)育與泌乳有調(diào)節(jié)作用。Li等利用體外細(xì)胞培養(yǎng)和qPCR等技術(shù)研究miR-15a在乳腺發(fā)育過程中的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-15a的靶基因?yàn)樯L(zhǎng)激素受體，通過抑制其表達(dá)限制奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖和酪蛋白的分泌[23]。Wang等發(fā)現(xiàn)多數(shù)miRNAs在奶牛泌乳期的表達(dá)顯著高于干乳期，比如miR-221、miR-33b、miR-31等，提示miRNAs對(duì)相關(guān)功能基因的調(diào)控與泌乳階段有關(guān)[24]。李真等證實(shí)，miR-484可靶向作用于牛己糖激酶2（Hexokinase 2,HK2）mRNA的3’UTR序列，通過抑制己糖激酶的活力，下調(diào)細(xì)胞對(duì)葡萄糖攝取能力[11]。

奶牛乳房炎是影響乳腺健康和正常生理功能的關(guān)鍵因素，目前有關(guān)miRNAs參與乳腺免疫的研究逐漸受到關(guān)注。高遷移率族蛋白（High-mobility group box protein,HMGB）是一種高度保守的核蛋白，可調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫應(yīng)答。有報(bào)道指出，在乳房炎感染的奶牛乳腺組織 中 ，參 與 調(diào) 控 HMGB3[25]的 miRNAs，包 括miR-17-5p、miR-20b和miR-93，以及調(diào)控HMGB1[26]的miR-223都出現(xiàn)顯著的表達(dá)下調(diào)，表明這些miRNAs可能參與到乳腺免疫活動(dòng)。2012年，Naeem等研究發(fā)現(xiàn)，在用乳房鏈球菌感染健康乳腺組織后，miR-181a、miR-16a和 miR-31大約下調(diào) 3-5倍，miR-223上調(diào)2.5倍。此外，miR-16a和miR-31推定的靶基因與免疫系統(tǒng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)。其中，miR-31推定的靶基因出現(xiàn)在細(xì)胞生長(zhǎng)與死亡、細(xì)胞通信等生物通路，并對(duì)脂類代謝有強(qiáng)烈抑制作用[27]。2013年，Lawless等采用高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)乳房鏈球菌感染的奶牛乳腺上皮細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)1300條已知牛成熟miRNAs序列及20多條新miRNAs。其中，21條miRNAs在感染后表達(dá)差異顯著，生物信息分析顯示這些miRNAs在免疫系統(tǒng)中有重要作用?？梢姡谌橄俳M織感染后，有關(guān)免疫、代謝和細(xì)胞增殖相關(guān)的信號(hào)通路都有可能部分地、在基因轉(zhuǎn)錄水平受miRNAs介導(dǎo)[28]。

3.2 miRNAs對(duì)奶山羊乳腺發(fā)育和泌乳的影響

盡管奶山羊具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，但相當(dāng)于奶牛來說，目前關(guān)于miRNAs在奶山羊乳腺發(fā)育和泌乳過程中調(diào)控作用的研究要少得多。

2013年，紀(jì)志賓等通過高通量測(cè)序、雙熒光素酶報(bào)告基因分析法和qRT-PCR等技術(shù)分析miR-143在奶山羊乳腺發(fā)育中的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：miR-143及其潛在靶基因1GFBP5在不同泌乳時(shí)期乳腺組織表達(dá)趨勢(shì)相同，均在泌乳高峰期低表達(dá)。同時(shí)，miR-143可抑制乳腺上皮細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)其凋亡。進(jìn)而可以推斷，miR-143可能通過調(diào)控IGFBP5表達(dá)促進(jìn)乳腺細(xì)胞的凋亡，從而參與乳腺的發(fā)育與泌乳[19]。

2012年，林先滋等采用數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)和自由能評(píng)估法，分析40個(gè)已知參與乳腺脂肪酸調(diào)控的基因3’-UTR上潛在的miRNA結(jié)合位點(diǎn)，篩選出9個(gè)可能與山羊乳腺脂肪酸代謝相關(guān)的miRNA[29]。隨后，他們通過構(gòu)建重組腺病毒表達(dá)載體，在奶山羊乳腺上皮細(xì)胞中過表達(dá)mi-200a，結(jié)果引起10個(gè)與乳脂合成相關(guān)基因mRNA表達(dá)量下調(diào)，6個(gè)上調(diào)。其中脂肪酸從頭合成相關(guān)基因FASN、脂滴生成相關(guān)基因TJP47（維脂滴蛋白)及脂肪酸運(yùn)輸相關(guān)基因FABP4（脂肪酸結(jié)合蛋白）降幅較大；而甘油三酯生成相關(guān)基因DGATl（甘油二脂?；D(zhuǎn)移酶1）和脂解相關(guān)基因HSL（激素敏感酯酶）則增幅靠前[30]。2013年，張犁蘋等利用qRT-PCR獲得山羊miR-200家族乳腺組織表達(dá)譜，通過分析miR-200家族各成員之間與山羊乳成分的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)miR-200家族可能對(duì)山羊乳蛋白及乳脂合成具有一定的調(diào)控作用，其中miR-200a/miR-141靶向作用于在乳脂合成中起關(guān)鍵作用的基因STAT4[31]。Lin等采用高通量測(cè)序技術(shù)大規(guī)模地挖掘泌乳期山羊乳腺miRNA，共計(jì)發(fā)現(xiàn)823個(gè)保守的miRNA，其中30個(gè)在乳腺中高表達(dá)，包括miR-103；在乳腺上皮細(xì)胞中過表達(dá)miR-103，會(huì)提高乳脂合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，從而上調(diào)脂滴的形成、甘油三酯的積累及不飽和脂肪酸的比例，表明miR-103表達(dá)水平與哺乳密切相關(guān)[32]。隨后，該研究小組對(duì)miRNAs協(xié)同調(diào)控奶山羊乳腺上皮細(xì)胞中乳脂合成等問題進(jìn)行了深入研究，他們選取miR-23a、miR-27b、miR-103和 miR-200a等 4個(gè)miRNAs進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn) 3 對(duì) miRNAs（miR-23a和miR-27b、miR-103 和 miR-200a、miR-27b 和miR-200a）間有較強(qiáng)的協(xié)同調(diào)控作用，為今后的乳脂合成分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究提供有效幫助[33]。

盡管關(guān)乳用動(dòng)物乳腺特異性miRNAs的研究得以有效展開，但相對(duì)于人、小鼠等模式生物來說，還有很大的提升空間，乳用動(dòng)物乳腺miRNAs的發(fā)現(xiàn)與鑒定還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，對(duì)其具體功能的研究也急需深入。

4 展望

乳腺是乳用動(dòng)物的生產(chǎn)器官，可以將營(yíng)養(yǎng)素轉(zhuǎn)化為乳成分并形成乳汁，是多產(chǎn)奶和產(chǎn)好奶的首要條件。因此，乳用動(dòng)物的乳腺重在健康發(fā)育和功能正常。從人類的營(yíng)養(yǎng)需求和動(dòng)物福利出發(fā)，如何最大化地提高乳產(chǎn)量和乳質(zhì)量又不影響泌乳乳用動(dòng)物的身體健康、繁殖能力和生產(chǎn)壽命，一直是乳腺發(fā)育與泌乳生物學(xué)研究的重要科學(xué)使命。隨著奶牛全基因組信息的完成以及山羊全基因測(cè)序工作的有效開展，乳用動(dòng)物乳腺miRNAs相關(guān)研究得以不斷深入，這必將帶動(dòng)整個(gè)乳腺發(fā)育與泌乳生物學(xué)研究的快速發(fā)展，其前沿研究領(lǐng)域也將逐漸趨向于泌乳功能基因組學(xué)、泌乳核心信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及其調(diào)節(jié)研究等，進(jìn)而深刻揭示乳腺發(fā)育與泌乳的基因調(diào)節(jié)機(jī)理。

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