乳用動物乳腺特異性miRNAs研究進展

曲波，王春梅，仇有文，袁肖寒，甄貞，姜毓君

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)a.乳品科學(xué)教育部重點實驗室，b.生命科學(xué)與生物技術(shù)研究中心，哈爾濱150030）

0 引言

2008年12月，農(nóng)業(yè)部發(fā)布的《乳用動物健康標準》中指出：“乳用動物是指用于生產(chǎn)供人類食用或加工用生鮮乳的奶牛、奶山羊等動物”。乳腺是乳用動物的生產(chǎn)器官，可以將營養(yǎng)素轉(zhuǎn)化為乳成分并形成乳汁。乳腺的發(fā)育涉及眾多激素和細胞因子參與。miRNAs（microRNAs）是一種廣泛存在的、對基因表達進行微調(diào)的分子，大量研究證實，miRNAs參與乳腺發(fā)育、泌乳和退化過程的諸多調(diào)節(jié)途徑[1-2]。

目前，有關(guān)miRNAs在乳腺發(fā)育和泌乳活動中作用和機制的研究還主要集中在人和小鼠等模式生物上，雖然與乳用動物乳腺特異性miRNAs有關(guān)的報道并不多，但相關(guān)的研究正逐漸成為乳腺發(fā)育與泌乳生物學(xué)研究的熱點[3]。本文就近年來奶牛與奶山羊乳腺miRNAs研究工作做一概述，為未來此領(lǐng)域的研究提供依據(jù)。

1 miRNAs與乳腺生物學(xué)

1.1 miRNAs 的預(yù)測與鑒定

miRNA（microRNA）是一類長約22 nt的內(nèi)源非編碼小分子RNA，由長約70 nt的發(fā)夾狀前體RNA（pre-miRNA）加工而成。已有研究證實，miRNAs在轉(zhuǎn)錄后水平迅速靈敏地調(diào)節(jié)著基因的表達，廣泛參與細胞發(fā)育、分化、增殖、凋亡、代謝、腫瘤轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)過程[4]。

雖然miRNAs的研究歷史很短，但其進展勢頭十分迅猛，迄今miRBase收錄的miRNAs已超過3萬條。近年來，隨著miRNAs研究的深入，各種miRNAs檢測技術(shù)也是層出不窮，但主要還是分為3類。一是傳統(tǒng)的克隆方法，這也是最早被應(yīng)用于檢測miRNAs領(lǐng)域的方法之一；二是新一代測序技術(shù)（next-generation sequencing，NGS），實現(xiàn)了高通量篩選新的miRNAs；最后是生物信息學(xué)方法，該法最具效率，應(yīng)用最廣，為NGS的高通量篩選提供技術(shù)保證，已成為尋找和鑒定miRNAs及靶基因的主要方法[5]。隨著人們對miRNAs及其靶基因性質(zhì)和特點的深入了解，以及物種基因組信息的完善，相信會有更多的miRNAs和靶基因被發(fā)現(xiàn)。

1.2 miRNAs在乳腺發(fā)育中的作用與機制

乳腺作為具有泌乳功能的哺乳動物特有器官，在其生長發(fā)育過程中經(jīng)歷著細胞生長、分化、增殖、凋亡等生命過程。哺乳動物生殖周期中乳腺的功能性分化是至關(guān)重要的。乳腺發(fā)育和泌乳活動都是通過神經(jīng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)進行調(diào)節(jié)。此外，激素和生長因子在乳腺不同階段的發(fā)育過程中起重要作用。miRNAs作為廣泛存在的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機制，主要靶向于信號分子、結(jié)點蛋白及信號蛋白，可能對傳統(tǒng)的神經(jīng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)細胞因子水平調(diào)節(jié)引入新的調(diào)控機制。隨著miRNAs的不斷發(fā)現(xiàn)和深入探索，有關(guān)miRNAs對乳腺發(fā)育和泌乳功能調(diào)控的研究也逐步展開。

Sdassi等人應(yīng)用克隆方法在乳腺中發(fā)現(xiàn)了24個乳腺發(fā)育的相關(guān)miRNAs基因并鑒定了其中6個，發(fā)現(xiàn)它們有一定的組織特異性[6]。李曄等發(fā)現(xiàn)，miR-195和miR-365對小鼠乳腺上皮細胞活性及增殖能力有抑制作用，還可降低小鼠乳腺上皮細胞乳糖分泌，抑制乳腺上皮細胞的泌乳能力[7]。李慧銘等應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法結(jié)合生物信息學(xué)、熒光定量PCR等技術(shù)證明，miR-142-3p對小鼠乳腺上皮細胞活性及增殖能力有抑制作用，對小鼠乳腺上皮細胞中酪蛋白和甘油三酯的合成分泌有抑制作用，其靶基因為PRLR[8]。

乳腺組織特異性miRNs的陸續(xù)發(fā)現(xiàn)及其相關(guān)靶基因的確定，初步揭示了其在乳腺發(fā)育和泌乳機能分化中的調(diào)控作用，而且其調(diào)控作用可能是一種調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，但目前miRNAs調(diào)控哪些細胞因子、哪些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，它們與信號分子的關(guān)系如何等問題，都亟待去揭示和探討。

2 乳用動物乳腺miRNAs的篩選與鑒定

2.1 奶牛乳腺miRNAs的篩選與鑒定

2009年，牛全基因組測序完成后，與奶牛健康、疾病、乳品質(zhì)相關(guān)的功能基因研究逐漸成為熱點，有關(guān)奶牛乳腺miRNAs的研究也較其他反芻動物多[9]。

早在2007年，Gu等就通過克隆的方法從牛乳腺和脂肪組織中鑒定出59個不同的miRNAs。其中miR-21、miR-23a、miR-24和miR-143在奶牛乳腺組織中大量表達[10]。

相對于傳統(tǒng)克隆方法的費時費力，高效、快速的大規(guī)模測序技術(shù)逐漸應(yīng)用到奶牛乳腺miRNAs的篩選上來。2012年，李真等以泌乳期和非泌乳期奶牛為對象，采用Solexa高通量測序技術(shù)共獲得884個奶牛乳腺miRNAs序列，其中已知序列283條，保守序列96條，新發(fā)現(xiàn)序列505條，同時獲得兩個時期miRNA的差異表達譜。在檢測到的69條差異miRNAs中，有45條miRNA在泌乳期表達顯著下調(diào)，表明miRNA在奶牛泌乳過程中存在重要的調(diào)控作用[11-12]。

值得注意的是，自Weber等于人母乳中篩選檢測到miRNAs以來，人母乳中已檢測到多種miRNAs[13]。近年來，有報道指出牛乳中也含有miRNAs。2012年，Izumi等通過基因芯片分別檢測健康荷斯坦牛初乳與常乳，結(jié)果共檢測到102個miRNAs，其中初乳中有100個，常乳中含53個，有51個miRNAs在初乳與常乳中都存在。該團隊還篩選出一些與免疫和發(fā)育密切相關(guān)的miRNAs進行熒光定量PCR驗證，包括miR-15b、miR-27b、miR-34a、miR-106b、miR-130a、miR-155和miR-223等，結(jié)果全部為陽性，而且初乳中的表達水平顯著高于常乳，暗示這些miRNAs與器官發(fā)育和免疫功能調(diào)節(jié)有關(guān)[14]。

2.2 奶山羊乳腺miRNAs的篩選與鑒定

山羊是最早被人類馴化的動物之一，但其基因組測序工作卻遠落后于其他家畜，這也使山羊miRNAs的研究工作極大受限。直到2012年底，山羊的基因組序列組裝才初步完成，該研究整合使用了NGS和最新的DNA單分子光學(xué)作圖技術(shù)，成功克服了山羊基因組的組裝難題，提供了首個小型反芻動物參考基因組[15]。盡管山羊基因組序列信息仍不完整，但隨著高通量技術(shù)的運用和生物信息學(xué)的迅猛發(fā)展，有關(guān)山羊乳腺miRNAs的挖掘工作還是逐步開展起來[4,16]。

2012年，Ji等以嶗山奶山羊不同發(fā)育時期乳腺為研究材料，分別構(gòu)建了泌乳初期、泌乳高峰期、泌乳末期三個miRNA文庫，并用Solexa高通量技術(shù)進行測序、篩選，結(jié)果在乳腺組織中獲得已知miRNAs 336個，新miRNAs 50個，顯著差異表達miRNAs 189個，表 達 豐 度 最 高 的 包 括 let-7a、let-7b、miR-143、miR-378、miR-148a等。通過進一步的生物信息學(xué)分析共獲得68條顯著富集的信號通路，且均富集到了MAPK、Wnt、Insulin、Jak-STAT等與泌乳有關(guān)的信號通路上[17-19]。隨后，Dong等通過生物信息學(xué)方法對其中一些差異顯著的miRNAs進行了靶基因預(yù)測與分析，結(jié)果獲得了22個miRNAs的215個靶基因，預(yù)示著它們在奶山羊乳腺發(fā)育過程中具有重要的調(diào)控功能，如與乳成分合成與運輸密切相關(guān)的miR-378、miR-423-5p和miR-7等[20]。同年，Li等對西農(nóng)薩能奶山羊干奶期和泌乳高峰期乳腺組織miRNAs轉(zhuǎn)錄組進行了比較研究，發(fā)現(xiàn)差異表達的miRNAs中包括346個保守的miRNAs和95個新miRNAs，其中表達差 異 較 高 有 miR-288、miR-199a、miR-451、miR-98、miR-247、miR-25、miR-199b、miR-128、miR-145、miR-222、miR-181b等[21]。

此外，還有一些研究團隊著眼于山羊睪丸、肌肉等特異miRNAs的鑒定工作，也都取得了較好的結(jié)果。

3 miRNAs對乳用動物乳腺發(fā)育和泌乳的影響

3.1 miRNAs對奶牛乳腺發(fā)育和泌乳的影響

奶牛乳腺發(fā)育與泌乳是一個復(fù)雜的過程，受到眾多調(diào)節(jié)因素的支配。近年來，miRNAs的調(diào)控作用越來越受到關(guān)注[22]。

大量研究證實miRNAs對奶牛乳腺發(fā)育與泌乳有調(diào)節(jié)作用。Li等利用體外細胞培養(yǎng)和qPCR等技術(shù)研究miR-15a在乳腺發(fā)育過程中的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-15a的靶基因為生長激素受體，通過抑制其表達限制奶牛乳腺上皮細胞的增殖和酪蛋白的分泌[23]。Wang等發(fā)現(xiàn)多數(shù)miRNAs在奶牛泌乳期的表達顯著高于干乳期，比如miR-221、miR-33b、miR-31等，提示miRNAs對相關(guān)功能基因的調(diào)控與泌乳階段有關(guān)[24]。李真等證實，miR-484可靶向作用于牛己糖激酶2（Hexokinase 2,HK2）mRNA的3’UTR序列，通過抑制己糖激酶的活力，下調(diào)細胞對葡萄糖攝取能力[11]。

奶牛乳房炎是影響乳腺健康和正常生理功能的關(guān)鍵因素，目前有關(guān)miRNAs參與乳腺免疫的研究逐漸受到關(guān)注。高遷移率族蛋白（High-mobility group box protein,HMGB）是一種高度保守的核蛋白，可調(diào)節(jié)細胞免疫應(yīng)答。有報道指出，在乳房炎感染的奶牛乳腺組織 中 ，參 與 調(diào) 控 HMGB3[25]的 miRNAs，包 括miR-17-5p、miR-20b和miR-93，以及調(diào)控HMGB1[26]的miR-223都出現(xiàn)顯著的表達下調(diào)，表明這些miRNAs可能參與到乳腺免疫活動。2012年，Naeem等研究發(fā)現(xiàn)，在用乳房鏈球菌感染健康乳腺組織后，miR-181a、miR-16a和 miR-31大約下調(diào) 3-5倍，miR-223上調(diào)2.5倍。此外，miR-16a和miR-31推定的靶基因與免疫系統(tǒng)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)。其中，miR-31推定的靶基因出現(xiàn)在細胞生長與死亡、細胞通信等生物通路，并對脂類代謝有強烈抑制作用[27]。2013年，Lawless等采用高通量測序技術(shù)檢測乳房鏈球菌感染的奶牛乳腺上皮細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)1300條已知牛成熟miRNAs序列及20多條新miRNAs。其中，21條miRNAs在感染后表達差異顯著，生物信息分析顯示這些miRNAs在免疫系統(tǒng)中有重要作用?？梢姡谌橄俳M織感染后，有關(guān)免疫、代謝和細胞增殖相關(guān)的信號通路都有可能部分地、在基因轉(zhuǎn)錄水平受miRNAs介導(dǎo)[28]。

3.2 miRNAs對奶山羊乳腺發(fā)育和泌乳的影響

盡管奶山羊具有重要的經(jīng)濟價值，但相當于奶牛來說，目前關(guān)于miRNAs在奶山羊乳腺發(fā)育和泌乳過程中調(diào)控作用的研究要少得多。

2013年，紀志賓等通過高通量測序、雙熒光素酶報告基因分析法和qRT-PCR等技術(shù)分析miR-143在奶山羊乳腺發(fā)育中的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：miR-143及其潛在靶基因1GFBP5在不同泌乳時期乳腺組織表達趨勢相同，均在泌乳高峰期低表達。同時，miR-143可抑制乳腺上皮細胞的增殖，并促進其凋亡。進而可以推斷，miR-143可能通過調(diào)控IGFBP5表達促進乳腺細胞的凋亡，從而參與乳腺的發(fā)育與泌乳[19]。

2012年，林先滋等采用數(shù)據(jù)庫預(yù)測和自由能評估法，分析40個已知參與乳腺脂肪酸調(diào)控的基因3’-UTR上潛在的miRNA結(jié)合位點，篩選出9個可能與山羊乳腺脂肪酸代謝相關(guān)的miRNA[29]。隨后，他們通過構(gòu)建重組腺病毒表達載體，在奶山羊乳腺上皮細胞中過表達mi-200a，結(jié)果引起10個與乳脂合成相關(guān)基因mRNA表達量下調(diào)，6個上調(diào)。其中脂肪酸從頭合成相關(guān)基因FASN、脂滴生成相關(guān)基因TJP47（維脂滴蛋白)及脂肪酸運輸相關(guān)基因FABP4（脂肪酸結(jié)合蛋白）降幅較大；而甘油三酯生成相關(guān)基因DGATl（甘油二脂酰基轉(zhuǎn)移酶1）和脂解相關(guān)基因HSL（激素敏感酯酶）則增幅靠前[30]。2013年，張犁蘋等利用qRT-PCR獲得山羊miR-200家族乳腺組織表達譜，通過分析miR-200家族各成員之間與山羊乳成分的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)miR-200家族可能對山羊乳蛋白及乳脂合成具有一定的調(diào)控作用，其中miR-200a/miR-141靶向作用于在乳脂合成中起關(guān)鍵作用的基因STAT4[31]。Lin等采用高通量測序技術(shù)大規(guī)模地挖掘泌乳期山羊乳腺miRNA，共計發(fā)現(xiàn)823個保守的miRNA，其中30個在乳腺中高表達，包括miR-103；在乳腺上皮細胞中過表達miR-103，會提高乳脂合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，從而上調(diào)脂滴的形成、甘油三酯的積累及不飽和脂肪酸的比例，表明miR-103表達水平與哺乳密切相關(guān)[32]。隨后，該研究小組對miRNAs協(xié)同調(diào)控奶山羊乳腺上皮細胞中乳脂合成等問題進行了深入研究，他們選取miR-23a、miR-27b、miR-103和 miR-200a等 4個miRNAs進行分析，發(fā)現(xiàn) 3 對 miRNAs（miR-23a和miR-27b、miR-103 和 miR-200a、miR-27b 和miR-200a）間有較強的協(xié)同調(diào)控作用，為今后的乳脂合成分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究提供有效幫助[33]。

盡管關(guān)乳用動物乳腺特異性miRNAs的研究得以有效展開，但相對于人、小鼠等模式生物來說，還有很大的提升空間，乳用動物乳腺miRNAs的發(fā)現(xiàn)與鑒定還遠遠不夠，對其具體功能的研究也急需深入。

4 展望

乳腺是乳用動物的生產(chǎn)器官，可以將營養(yǎng)素轉(zhuǎn)化為乳成分并形成乳汁，是多產(chǎn)奶和產(chǎn)好奶的首要條件。因此，乳用動物的乳腺重在健康發(fā)育和功能正常。從人類的營養(yǎng)需求和動物福利出發(fā)，如何最大化地提高乳產(chǎn)量和乳質(zhì)量又不影響泌乳乳用動物的身體健康、繁殖能力和生產(chǎn)壽命，一直是乳腺發(fā)育與泌乳生物學(xué)研究的重要科學(xué)使命。隨著奶牛全基因組信息的完成以及山羊全基因測序工作的有效開展，乳用動物乳腺miRNAs相關(guān)研究得以不斷深入，這必將帶動整個乳腺發(fā)育與泌乳生物學(xué)研究的快速發(fā)展，其前沿研究領(lǐng)域也將逐漸趨向于泌乳功能基因組學(xué)、泌乳核心信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及其調(diào)節(jié)研究等，進而深刻揭示乳腺發(fā)育與泌乳的基因調(diào)節(jié)機理。

[1]李慶章，高學(xué)軍，曲波，等.奶山羊乳腺發(fā)育于泌乳生物學(xué)[M].北京：科學(xué)出版社，2011,11-24.

[2]AMBROS V.The functions of animal microRNAs[J].Nature.,2004,431:350-355.

[3]WANG X,GU Z,JIANG H.MicroRNAs in farm animals[J].Animal.,2013（3）:1-9.

[4]FATIMA A,MORRIS D G.MicroRNAs in domestic livestock[J].Physiol.Genomics.,2013,45(16):685-696.

[5]HUANG Y,ZOU Q,WANG S P,et al.The discovery approaches and detection methods of microRNAs[J].Mol.Biol.Rep.,2011,38(6):4125-4135.

[6]SDASSI N,SILVERI L,LAUBIER J,et al.Identification and characterization of new miRNAs cloned from normal mouse mammary gland[J].BMC.Genomics.,2009,10:149-157.

[7]李曄.miRNA-195和miRNA-365對小鼠乳腺中STAT1及PIAS1的作用[D].哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

[8]李慧銘.miR-142-3p對小鼠乳腺發(fā)育和泌乳重要功能基因Prlr的表達調(diào)控[D].哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

[9]BOVINE GENOME SEQUENCING AND ANALYSIS CONSORTIUM,Elsik C G,Tellam R L,et al.The genome sequence of taurine cattle:a window to ruminant biology and evolution[J].Science.,2009,324(5926):522-528.

[10]GU Z,ELESWARAPU S,JIANG H.Identification and characterization of microRNAs from the bovine adipose tissue and mammary gland[J].FEBS.Lett.,2007,581(5):981-988.

[11]李真.奶牛乳腺組織中miRNA表達譜研究以及與泌乳相關(guān)miRNA的鑒定[D].杭州：浙江大學(xué)，2012.

[12]LI Z,LIU H,JIN X,et al.Expression profiles of microRNAs from lactating and non-lactating bovine mammary glands and identification of miRNA related to lactation[J].BMC.Genomics.,2012,3:731-742.

[13]WEBER J A,BAXTER D H,ZHANG S,et al.The microRNA spectrum in 12 body fluids[J].Clin.Chem.,2010,56(11):1733-1741.[14]IZUMI H,KOSAKA N,SHIMIZU T,et al.Bovine milk contains microRNA and messenger RNA that are stable under degradative conditions[J].J.Dairy.Sci.,2012,95(9):4831-4841.

[15]DONG Y,XIE M,JIANG Y,et al.Sequencing and automated whole-genome optical mapping of the genome of a domestic goat(Capra hircus)[J].Nat,Biotechnol.,2013,31(2):135-141.

[16]LIU H C,HICKS J A,TRAKOOLJUL N,et al.Current knowledge of microRNA characterization in agricultural animals[J].Anim.Genet.,2010,41(3):225-231.

[17]JI Z,WANG G,XIE Z,et al.Identification of novel and differentially expressed MicroRNAs of dairy goat mammary gland tissues using solexa sequencing and bioinformatics[J].PLoS,One.,2012,7(11):e49463.

[18]JI Z,WANG G,XIE Z,et al.Identification and characterization of microRNA in the dairy goat(Capra hircus)mammary gland by Solexa deep-sequencing technology[J].Mol.Biol.Rep.,2012,39(10):9361-9371.

[19]紀志賓.奶山羊泌乳期乳腺組織microRNA表達譜分析及miR-143調(diào)控IGFBP5對細胞作用研究[D]泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

[20]DONG F,JI Z B,CHEN C X,et al.Target Gene and Function Prediction of Differentially Expressed MicroRNAs in Lactating Mammary Glands of Dairy Goats[J].Int.J.Genomics.,2013,2013:917342.

[21]LI Z,LAN X,GUO W,et al.Comparative transcriptome profiling of dairy goat microRNAs from dry period and peak lactation mammary gland tissues[J].PLoS.One.,2012,7(12):e52388.

[22]金曉露，楊建香，李真，劉紅云，劉建新.乳腺發(fā)育及泌乳相關(guān)miRNA研究進展[J].遺傳.2013,35(6):695-702.

[23]LI H M,WANG C M,LI Q Z,et al.MiR-15a decreases bovine mammary epithelial cell viability and lactation and regulates growth hormone receptor expression[J].Molecules.,2012 Oct 12；17(10):12037-48.doi:10.3390/molecules171012037.

[24]WANG M,MOIS?S,KHAN M J,et al.MicroRNA expression patterns in the bovine mammary gland are affected by stage of lactation[J].J.Dairy.Sci.,2012,95(11):6529-6535.

[25]LI L,HUANG J,JU Z,et al.Multiple promoters and targeted microRNAs direct the expressions of HMGB3 gene transcripts in dairy cattle[J].Anim.Genet.,2013,44(3):241-250.

[26]LI L,HUANG J,ZHANG X,et al.One SNP in the 3'-UTR of HMGB1 gene affects the binding of target bta-miR-223 and is involved in mastitis in dairy cattle[J].Immunogenetics.,2012,64(11):817-824.

[27]LAWLESS N,FOROUSHANI A B,MCCABE M S,et al.Next generation sequencing reveals the expression of a unique miRNA profile in response to a gram-positive bacterial infection[J].PLoS.One.,2013,8(3):e57543.

[28]NAEEM A,ZHONG K,MOIS?S J,et al.Bioinformatics analysis of microRNA and putative target genes in bovine mammary tissue infected with Streptococcus uberis[J].J.Dairy.Sci.,2012,95(11):6397-6408.

[29]林先滋，羅軍，張犁蘋，等.miR-200a對奶山羊乳腺上皮細胞乳脂合成相關(guān)基因mRNA表達的影響[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報.2012,43(7):1028-1036.

[30]林先滋；羅軍；張犁蘋，等.調(diào)控山羊乳腺脂肪酸代謝miRNAs篩選及相關(guān)pri-miRNAs克隆驗證[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報.2012,20(2):589-598.

[31]張犁蘋，羅軍，林先滋，等.miR-200家族在西農(nóng)薩能奶山羊乳腺組織中的表達分析[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報.2013,44(6):944-951.

[32]LIN X,LUO J,ZHANG L,et al.MiR-103 Controls Milk Fat Accumulation in Goat(Capra hircus)Mammary Gland during Lactation[J].PLoS.One.,2013,8(11):e79258.

[33]LIN X,LUO J,ZHANG L,Zhu J.MicroRNAs synergistically regulate milk fat synthesis in mammary gland epithelial cells of dairy goats[J].Gene.Expr.,2013；16(1):1-13.