丙戊酸鈉對癲癇大鼠海馬GFAP表達(dá)的影響

高 然 裴雪梅 屠恩遠(yuǎn) 張文武

廣東深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院急診科 深圳 518101

癲癇（epilepsy）是一組由于腦部神經(jīng)元異常過度放電所引起的突然、短暫、反復(fù)發(fā)作的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常的慢性疾病和綜合征。近些年研究發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞（AST）可通過維持神經(jīng)元內(nèi)環(huán)境，抑制神經(jīng)遞質(zhì)失衡，減少苔鮮狀纖維發(fā)芽抑制癇樣放電產(chǎn)生，在抗癲癇中發(fā)揮越來越重要的作用［1］。丙戊酸鈉可治療數(shù)種癲癇發(fā)作，其作用強(qiáng)，不良反應(yīng)小，已被臨床廣泛應(yīng)用，但對此藥的治療原理及作用途徑尚未完全闡明。本研究通過制備大鼠癲癇模型并予丙戊酸鈉作干預(yù)，對比AST激活的生化指標(biāo)星形膠質(zhì)細(xì)胞酸性蛋白（GFAP）變化是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義以探討丙戊酸鈉作用途徑。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物分組：云南系健康成年雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量（350±20）g，隨機(jī)分為4組，每組各10只：①正常對照組：未給予任何干預(yù)措施。②正常給藥組：正常大鼠予丙戊酸鈉灌胃。③癲癇模型組：以馬桑內(nèi)脂為致癲劑造癲癇模型，未用丙戊酸鈉治療。④癲癇治療組：以馬桑內(nèi)脂為致癲劑造癲癇模型，用丙戊酸鈉灌胃治療。

1.1.2 藥品試劑、儀器：丙戊酸鈉緩釋片（德巴金，賽諾菲安萬特制藥有限公司），GFAP抗體ZA-0117及PV-9000免疫組化檢測試劑盒（均為北京中杉金橋生物公司），光學(xué)顯微鏡（Olympus），電動切片機(jī)2245型（Laica），Ax07TRF-A熒光顯微成像系統(tǒng)（Olympus）拍攝圖像。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動物模型的制備及取材：每次造模均在上午9時～11時進(jìn)行。取大鼠稱質(zhì)量后按10μL／g劑量吸取致癲劑馬桑內(nèi)脂，微量注射器將馬桑內(nèi)脂注入大鼠腦室內(nèi)，觀察其活動以Racine做標(biāo)準(zhǔn)：1級：動須、咀嚼；2級：節(jié)律性點(diǎn)頭；3級：一側(cè)前肢陣攣；4級：站立伴雙前肢陣攣；5級：4級＋跌倒伴全身抽搐。達(dá)到3級或3級以上為制備成功標(biāo)準(zhǔn)。4組在相同條件（清潔、通風(fēng)、恒溫、恒濕）下飼養(yǎng)7d，正常給藥組、癲癇治療組每天均在同一時間作灌胃（丙戊酸鈉100mg／kg）治療。

1.2.2 固定及取材：作灌注固定，乙醚麻醉大鼠，固定四肢，開胸找到心包膜剪開，穿刺針從心尖部刺入主動脈時用止血鉗夾閉，先輸生理鹽水并剪開右心耳觀察流出液體量和澄清度，當(dāng)流出液體變澄清，肝臟變白時，繼輸4%多聚甲醛，先快后慢，見大鼠出現(xiàn)肌抖動消失后繼續(xù)灌注30min。破顱骨后完整的取出腦組織放入4%多聚甲醛中繼續(xù)浸泡固定，浸泡固定時間為6h溫度4℃。

1.2.3 免疫組化：常規(guī)脫水、包埋后切片，大鼠大腦行冠狀切片，片厚4μm，每5張取1張。以SABC法，脫蠟，滅活內(nèi)源性酶并行修復(fù)抗原，5%BSA封閉滴加已稀釋成1：150的一抗（小鼠抗GFAP）4℃過夜，加二抗用DAB顯色。蘇木素輕度復(fù)染，脫水透明封片，顯微鏡觀察。用Olympus光學(xué)照像（關(guān)閉自動白平衡）海馬區(qū)域內(nèi)隨機(jī)照5張片，用ImagePro-Plus圖像分析軟件分析，測得每張照片中陽性細(xì)胞面積、平均光密度和累積光密度，取各指標(biāo)的平均值為一例標(biāo)本的代表值，得4組共200例標(biāo)本的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)均以（±s）表示。

1.3 數(shù)據(jù)分析 用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件包處理數(shù)據(jù)。對免疫組化測得的各組數(shù)據(jù)分別作正態(tài)分布檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，符合條件后采用單因素方差分析（one-way ANOVA）兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1 光鏡觀察 光鏡觀察：見已被染成棕色的GFAP陽性蛋白質(zhì)存在于AST胞漿，并呈現(xiàn)出整個細(xì)胞的輪廓及細(xì)胞的突觸。與正常對照組相比正常給藥組幾乎無變化，而癲癇模型組變化明顯，可見AST腫大，突觸增多，呈明顯的星形。癲癇治療組與癲癇模型組相比AST腫大稍減輕，但其突觸較明顯變長，和正常對照組相比也有明顯的差別（見圖1～4）。

Image-Pro Plus6.0測得大鼠海馬CA1、CA3區(qū)GFAP陽性細(xì)胞面積、平均光密度和累積光密度。從面積上觀察，正常對照組與正常給藥組CA1、CA3區(qū)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），正常對照組與癲癇模型組、癲癇治療組CA1、CA3區(qū)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

從各組累積光密也得到相似的結(jié)果，正常對照組與正常給藥組CA1、CA3區(qū)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），正常對照組與癲癇模型組、癲癇治療組CA1、CA3區(qū)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表1 4組GFAP免疫組化圖像分析結(jié)果 （±s）

表1 4組GFAP免疫組化圖像分析結(jié)果 （±s）

注：▲P＜0.01vs生理鹽水組、正常組；★P＜0.05vs癲癇模型組

組別 n 細(xì)胞面積 累積光密度 平均光密度CA1 CA3 CA1 CA3 CA1 CA3正常對照組 10 307.14±35.50 298.55±42.00 15990.02±2954.68 16184.58±3576.26 0.4121±0.0737 0.4048±0.0639正組給藥組 10 302.54±40.80 312.76±33.45 16035.59±2623.83 15637.09±2802.50 0.3794±0.0504 0.3966±0.0655癲癇模型組 10 716.34±57.62▲ 703.61±60.09▲50533.78 ±4574.60▲49701.62 ±4959.65▲0.7066 ±0.1041▲ 0.6779±0.0794▲癲癇治療組 10 499.75±54.74▲ 508.11±56.96▲31996.24 ±3870.87▲31185.73 ±5343.20▲0.6410 ±0.0908★ 0.6181±0.0881★

平均光密度看，癲癇模型組與正常對照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），與癲癇治療組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（見表1）。

圖1 癲癇模型組GFAP免疫組化陽性細(xì)胞（↑）SABC法400×

圖2 癲癇模型組GFAP免疫組化陽性細(xì)胞（↑）SABC法400×

圖3 癲癇模型組GFAP免疫組化陽性細(xì)胞（↑）SABC法400×

圖4 癲癇模型組GFAP免疫組化陽性細(xì)胞（↑）SABC法400×

2.2 圖像分析軟件結(jié)果見表1。

3 討論

作為治療成人和兒童全面和部分發(fā)作性癲癇最常用的抗癲癇藥物之一，丙戊酸鈉曾進(jìn)行多種癲癇發(fā)作的動物模型實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其治療癲癇時所表現(xiàn)的廣泛抗癲癇活性以及對其他腦病的療效不能用某一種藥理機(jī)制闡述清楚?，F(xiàn)多項(xiàng)研究只證實(shí)了丙戊酸鈉可以促進(jìn)GABA傳導(dǎo)，增強(qiáng)了特定腦區(qū)GABA能抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的功能［2-3］。

本研究予丙戊酸鈉作為干預(yù)因素，對比用藥組與非用藥組癲癇大鼠海馬GFAP表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)癲癇模型組大鼠AST被激活，細(xì)胞腫脹、突觸增多、GFAP表達(dá)增強(qiáng)；丙戊酸鈉治療組AST腫脹減輕、GFAP表達(dá)下降，結(jié)果提示丙戊酸鈉可減弱已激活的AST。AST正常狀態(tài)下可對神經(jīng)元有支持、絕緣、攝取化學(xué)物質(zhì)及以對神經(jīng)元修復(fù)和再生的功能，而激活后的AST卻可促進(jìn)癲癇［4］：（1）激活后形態(tài)改變：激活后的AST與神經(jīng)元之間連接異常、突觸囊泡釋放增多等變化，是促進(jìn)癲癇發(fā)作的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。（2）激活后分泌功能改變：激活后的AST使IL、TNF-a等細(xì)胞因子過度增加，通過電壓門控通道提高神經(jīng)元興奮性，同時也使神經(jīng)元線粒體腫脹，細(xì)胞蛋白分解過多，神經(jīng)元壞死，膠質(zhì)瘢痕形成。（3）激活后的AST使神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)紊亂，增強(qiáng)神經(jīng)元攝取谷氨酸，興奮性遞質(zhì)堆積［5］。所以丙戊酸鈉可通過減弱已激活的AST而發(fā)揮抗癲癇作用。依據(jù)其藥理推測其影響AST途徑是通過改變IL-1β、IL-6、腫瘤壞死因子、表皮生長因子等改變了細(xì)胞的活性。同時也有試驗(yàn)證實(shí)丙戊酸鈉對在抗痙攣?zhàn)饔闷鹦陂g，可以改變cGMP水平對抗癲癇。而丙戊酸并不能直接影響cAMP水平，猜測這種影響可能是繼發(fā)于影響其他細(xì)胞的結(jié)果［6］，這是否為丙戊酸鈉影響AST的結(jié)果？可依此試驗(yàn)為基礎(chǔ)結(jié)合以上種種推斷，對比丙戊酸鈉干預(yù)后AST中IL、TNF-a及cAMP的變化，可進(jìn)一步闡明丙戊酸鈉抗癲癇的機(jī)制。

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