響應面法優(yōu)化酪蛋白酶法水解條件

白騰輝，潘潤淑，馬亞萍，項豐娟，馬漢軍

(河南科技學院食品學院，河南新鄉(xiāng)453003)

酪蛋白在牛奶中約占80%，是一種重要的乳源全蛋白，具有較高的營養(yǎng)價值［1］，其在食品、保健品等領(lǐng)域有著廣泛的應用前景。酪蛋白中蘊涵著多種生物活性肽，這些活性肽具有抗菌、降血壓、抗凝血、調(diào)節(jié)免疫、結(jié)合礦物質(zhì)(Ca2+、Fe2+、Zn2+)、抗氧化和促進雙歧桿菌增殖等的功能特性［2］，但由于酪蛋白在胃中易形成較大堅硬結(jié)塊，蘊藏其中的生物活性多肽并無活性。研究表明，酶法水解是蛋白質(zhì)改性，有效改善其物理、化學性質(zhì)，提高其適口性、貯存與營養(yǎng)特性的最有效途徑之一［3-4］，使得蛋白水解后產(chǎn)生的肽段更易于機體的吸收、轉(zhuǎn)運及利用［5］。且因其作用過程溫和，易于控制，專一性強，效率高，且不破壞氨基酸結(jié)構(gòu)等，已成為當今國際蛋白質(zhì)加工領(lǐng)域最有前途的發(fā)展方向之一［6］。

目前，在蛋白質(zhì)酶法水解制備生物活性肽領(lǐng)域研究較多的是采用單一性酶，缺乏對比性。有鑒于此，本實驗選用五種酶對酪蛋白進行水解，從中篩選出酪蛋白水解的最佳用酶;之后再通過單因素和響應曲面實驗對該酶酶解過程的主要影響因子進行優(yōu)化，確定酪蛋白酶法水解的最佳條件。以期為改善酪蛋白水解物生物活性，為制備、開發(fā)生物活性肽及其產(chǎn)品提供更具說服力的指導，同時也為進一步探索酪蛋白酶解機理打下基礎(chǔ)。因此，酪蛋白的酶解處理對擴大其應用范圍及新型乳源蛋白制品的開發(fā)有著重要的促進作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

胰蛋白酶 aladdin(上海晶純生化科技股份有限公司)，酶活力1∶250;胃蛋白酶 aladdin，酶活力1∶15000;木瓜蛋白酶 aladdin，酶活力≥3u/mg;堿性蛋白酶 Solarbio(北京索萊寶科技有限公司)，酶活力≥200u/mg;中性蛋白酶 Solarbio，酶活力≥60u/mg;酪蛋白 Solarbio，含量≥85%;甲醛，鹽酸，氫氧化鈉，磷酸鹽等 所用其他化學試劑均為分析純。

FA224型電子天平 上海舜宇恒平科學儀器有限公司;79-1磁力加熱攪拌器 江蘇正基儀器有限公司;SHA-C數(shù)顯水浴恒溫振蕩器 江蘇省金壇市華峰儀器有限公司;電子萬用爐 北京光明醫(yī)療儀器廠;PHS-3C型精密pH計 上海雷磁儀器廠;KjeltecTM8400全自動凱氏定氮儀 FOSS Denmark。

表2 各酶粗略水解條件及結(jié)果Table 2 The rough hydrolysis conditions and results of each enzyme

1.2 實驗方法

1．2．1 酪蛋白水解工藝流程 在50mL蒸餾水中加入酪蛋白(10mg/mL)→磁力攪拌器上充分攪拌使其溶解→調(diào)溶液pH→加定量酶→恒溫振蕩器內(nèi)水解→100℃水浴滅酶10min→冷卻至室溫→指標測定。

1．2．2 水解酶的選擇 根據(jù)文獻［7］，初步確定各酶粗略的最適水解條件，按照1．2．1的水解步驟進行水解，通過水解度、水解風味及水解液外觀來確定水解酪蛋白的較優(yōu)酶。

1．2．3 單因素實驗 取上述較優(yōu)酶水解酪蛋白，以水解度為測定指標，測定不同 pH(1．0、1．5、2．0、2．5、3．0)、溫度(40、45、50、55、60℃)、加酶量(0．5、1．0、1．5、2．0、2．5 mg/mL)及酶解時間(2、4、6、8、10 h)對酶解效率的影響，初步確定該酶的適宜酶解范圍。

1．2．4 酶解工藝條件的響應曲面實驗設(shè)計 在單因素實驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計原理，以酪蛋白酶解過程中的水解度為響應值，選取pH、溫度及加酶量為影響因子，進行3因素3水平響應面實驗，確定酪蛋白酶解的最佳工藝參數(shù)。實驗因素水平表見表1。

表1 響應面實驗因素水平編碼表Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1．2．5 水解度的測定 甲醛滴定法測水解度［8-9］，取蛋白酶解液5mL置于100mL容量瓶中，定容、混勻后取20mL置于200mL燒杯中，加入60mL去CO2水，用0．05mol/L標準 NaOH 溶液滴定至 pH8．2。加入10mL甲醛溶液，混勻后再用0．05mol/L標準 NaOH溶液繼續(xù)滴定至pH9．2，同時用蒸餾水代替酶解液做空白對照。記錄所消耗的標準NaOH溶液的體積，計算水解度(DH)。

式中:c為標準NaOH溶液濃度，mol/L;V1為樣品消耗氫氧化鈉標準滴定溶液的體積，mL;V2為試劑空白消耗氫氧化鈉標準滴定溶液的體積，mL;V3為試劑稀釋液取用量，為1mL(5mL酶解液定容100mL后取用20mL);S為底物濃度(mg/mL);W為樣品中蛋白質(zhì)含量，本實驗所用酪蛋白樣品中蛋白質(zhì)含量用全自動凱氏定氮儀，微量凱氏定氮法［10］測定，為87．34%;htot為蛋白質(zhì)中肽鍵總數(shù) mmol/g，酪蛋白中肽鍵總數(shù)為8．2×10-3mmol/g。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實驗數(shù)據(jù)均重復三次，采用Spass 14．0和Design Expert 7．0對各實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 酪蛋白水解酶的確定

不同的酶切方式對酪蛋白酶解液的乳化性、疏水性等指標均有不同程度的影響，從而呈現(xiàn)出不同的水解程度和感官品質(zhì)［11］。分別采用胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶及中性蛋白酶在各自最適條件下水解定量酪蛋白，其較適宜水解條件及水解結(jié)果見表2。

從表2中可以看出，5種酶對酪蛋白的水解效果各有所不同。采用中性蛋白酶水解酪蛋白時的水解度最高，但其水解液有明顯的苦味、異味，且有些許的渾濁現(xiàn)象，不易于后期處理;木瓜蛋白酶水解后獲得的水解液有較好的感官，但水解度較低;而胰蛋白酶、胃蛋白酶、堿性蛋白酶的水解液的風味、外觀變化不大，但胃蛋白酶在水解酪蛋白時有較高的水解度。綜合考慮上述實驗結(jié)果，篩選出胃蛋白酶為水解酪蛋白的最佳用酶。

2.2 胃蛋白酶水解酪蛋白的單因素實驗

水解度是檢測和控制酪蛋白水解程度的重要指標，所得水解物的營養(yǎng)價值和功能特性以及水解過程生成的苦味肽的多少均與之有關(guān)［12］。根據(jù)2．1確定的胃蛋白酶粗略的適宜水解條件進行酶解單因素實驗，以水解度(DH)為測定指標，確定各個因素較佳的酶解反應范圍。

由圖1可知，在pH1．5左右，胃蛋白酶對酪蛋白的水解程度顯示出最大值，超過此pH時，胃蛋白酶的活性明顯降低，酪蛋白水解度迅速下降。該酶適宜的水解溫度為 55℃左右，最佳酶用量為 1．5～2．5mg/mL，較好的酶解時間為6h以上。

2.3 胃蛋白酶水解酪蛋白的響應面優(yōu)化實驗

圖1 不同pH(a)、溫度(b)、酶量(c)、酶解時間(d)對酶解產(chǎn)物DH的影響Fig．1 The effects of different pH(a)，temperature(b)，enzyme concentration(c)and time(d)on hydrolysates’degree of hydrolysis

根據(jù)2．2的單因素實驗結(jié)果，從中選出對實驗影響較大的三個因子(pH、溫度、酶量)，按表1進行3因素3水平的Box-Behnken的實驗設(shè)計，實驗設(shè)計及結(jié)果見表3。

采用Statistica8．0分析軟件對表3的結(jié)果進行回歸分析，方差分析結(jié)果見表4。

由表4可以看出，模型的p值＜0．0001，說明回歸模型極顯著。失擬項p=0．055＞0．05不顯著，說明該模型有較好的擬合度。根據(jù)回歸系數(shù)，可得酪蛋白水解度的二次多項回歸方程為:DH=9．88250X1+2．79975X2+0．26X3-0．018X1X2+0．11X1X3+1E-003X2X3-3．02X12-0．0256X22-0．15X32-74．39。回歸系數(shù)的顯著性分析結(jié)果表明為極顯著項，X1、X2項顯著，其他項均不顯著，說明pH及溫度對水解度的影響較大。由方差分析結(jié)果可知，研究范圍內(nèi)的3個因素對水解度影響的大小順序為:X1＞X2＞X3，即pH＞溫度＞加酶量。

表3 響應面分析實驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Results of response surface experiments

通過響應面的數(shù)字最優(yōu)組合分析得到酪蛋白的最佳酶解條件為:pH1．31、加酶量 1．75mg/mL、溫度57．37℃，最優(yōu)條件下水解度為 9．45% 。

2．3．1 pH和溫度之間的交互作用的分析與優(yōu)化 圖2為pH與溫度之間的交互作用，加酶量2mg/mL，酶解時間6h，當溫度一定時，隨著pH的升高，酪蛋白的水解度迅速上升后又下降;當pH不變時，水解度也呈現(xiàn)出迅速上升后又下降的趨勢。表明pH、溫度過高過低都不利于酪蛋白的水解。等高線圖呈橢圓形，說明pH與溫度的交互作用顯著。等高線沿溫度方向的軸向比pH軸向密集，說明溫度對酪蛋白水解程度的影響比pH的影響大。

圖2 pH和溫度對酪蛋白水解度影響的響應面圖Fig．2 Response surface graph of pH and temperature on the degree of casein hydrolysis

2．3．2 pH和加酶量之間的交互作用的分析與優(yōu)化 從圖3可以看出，加酶量不變時，隨著pH的升高，酪蛋白的水解度先上升后又下降，升高和下降的幅度都很明顯;當pH處于較高或較低水平時，酶量的增加對水解度的影響不大，當pH處于中等水平時，隨著加酶量的增大，酪蛋白水解度平穩(wěn)升高后穩(wěn)定。加酶量與pH的交互作用顯著。pH曲線較陡，加酶量的曲線相對平緩軸向密集，說明pH對酪蛋白水解程度的影響比加酶量的影響大。

表4 二次響應面回歸模型方差分析表Table 4 Analysis of variance for the fitted quadratic response surface regression model

圖3 pH和加酶量對酪蛋白水解度影響的響應面圖Fig．3 Response surface graph of pH andenzyme concentration on the degree of casein hydrolysis

2．3．3 溫度和加酶量之間的交互作用的分析與優(yōu)化 圖4為加酶量和溫度之間的交互作用，pH1．5，酶解時間6h。當溫度一定時，隨著酶量的升高，酪蛋白的水解度平緩上升后穩(wěn)定;當加酶量不變時，水解度隨溫度的升高呈現(xiàn)出上升后又迅速下降的趨勢。橢圓形等高線圖說明加酶量與溫度間的交互作用顯著。等高線沿溫度方向的軸向比加酶量軸向密集，說明溫度對酪蛋白水解程度的影響比加酶量的影響大。

2．3．4 酶解最佳工藝條件的確定及驗證結(jié)果 為驗證響應面所得結(jié)果的可靠性，采用由Design Expert軟件得到的胃蛋白酶酶解酪蛋白的最佳工藝條件(pH1．31、加酶量1．75mg/mL、溫度57．37℃)對其進行驗證，考慮到實驗的實際可操作性，將工藝參數(shù)中的pH修正為1．3，水解溫度修正為57℃。在此條件下水解6h，三次平行實驗所得的酪蛋白平均水解度為9．18%，與預測值9．45%基本相符。說明采用此方法優(yōu)化得到的酪蛋白水解條件與實際擬合較好，具有實用價值。

圖4 溫度和加酶量對酪蛋白水解度影響的響應面圖Fig．4 Response surface graph of temperature and enzyme concentration on the degree of casein hydrolysis

3 結(jié)論

通過比較不同蛋白酶對酪蛋白水解效果的影響，選定胃蛋白酶為酪蛋白水解的最佳用酶。在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用響應面法對該酶酶解過程中的主要影響因子進行優(yōu)化，建立了較合理有效的水解度與pH、溫度、加酶量的數(shù)學模型，該模型能較好的預測胃蛋白酶酶解酪蛋白的水解程度。

應用響應面法優(yōu)化得到的酪蛋白酶法水解的最佳條件為:pH1．3、加酶量 1．75mg/mL、溫度 57℃，此時水解度為9．18%，與模型驗證的水解度9．45%非常接近。說明響應面法能較好的用于酪蛋白酶解工藝的優(yōu)化，可為酪蛋白酶解的進一步研究及生物活性肽類產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

［1］Sarah W，Gojka R．Global burden of diabetes mellitus in the year 2000［J］．Geneva:WHO，2000．

［2］朱少娟，施用暉，樂國偉．超聲波對胰蛋白酶水解酪蛋白的影響［J］．食品與生物技術(shù)學報，2005，240(1):50-54．

［3］Li Zhao，Zhang Wang，Shi ying X u．Preparation of casein phosphorylated peptides and casein non-phosphorylated peptides using alealase［J］．Eur Food Technol，2007，225:579-584．

［4］Meisel H，Schlimme E．Milk protein precursors of bioactive peptides［J］．Trends Food Sci Technol，1990，1:41-43．

［5］郭本恒，孔保華．保健與功能食品［M］．哈爾濱:黑龍江科學技術(shù)出版社，1996．

［6］周雪松，趙謀明．雞肉蛋白酶解及其產(chǎn)物抗氧化活性研究［D］．廣州:華南理工大學，2006．

［7］黃文濤，胡學智譯．酶應用手冊［M］．上海:上海科學技術(shù)出版社，1989．

［8］GB/T 5009．39-2003，醬油衛(wèi)生標準的分析方法［S］．中華人民共和國國家標準，2003．

［9］武彥文，張燕，閻晶辰，等．酶法水解植物蛋白制備肉味兒香精的研究［J］．食品工業(yè)科技，2003，24(3):53-55．

［10］魏廣東．水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測手冊［M］．北京:中國標準出版社，2005:120-133．

［11］曹仁嬌，劉春紅，馮志彪．不同酶切方式對乳清蛋白疏水性和乳化性的影響［J］．中國乳品工業(yè)，2011，39(10):15-22．

［12］檀志芬，生慶海，邱泉若，等．蛋白質(zhì)水解度的測定方法［J］．分析檢測，2005，26(7):174-176．