蠶蛹蛋白腸內(nèi)營養(yǎng)制劑干預(yù)2型糖尿病小鼠代謝特性的研究

趙清波，吳文惠，周 喻，朱長林，陳佳捷，張朝燕，包 斌，*

(1．上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306;2．上海市第六人民醫(yī)院，上海201306;3．上海海洋大學(xué)海洋藥物與健康食品研究中心，上海201306)

蠶蛹(Silkworm pupa)為蠶蛾科昆蟲家蠶蛾(Bombyx moil L．)的蛹，其資源豐富，蛋白營養(yǎng)全面均衡，干蠶蛹中含55%～60% 的粗蛋白［1］。蠶蛹蛋白(silkworm pupae protein，SPP)是一種較為理想的優(yōu)質(zhì)純天然全價蛋白質(zhì)，含有18種氨基酸，占蠶蛹總氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的35%，其中8種人體必需氨基酸含量高達(dá)42．20%，必需氨基酸與非必需氨基酸質(zhì)量比優(yōu)于WHO/FAO提出的氨基酸參考模式［2-3］，除此以外還富含核黃素、尼克酸、鋅、鐵、銅等營養(yǎng)素［4］。SPP是一種很好的藥用原料，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明，SPP具有提高免疫力［5］、抗腫瘤［6］、抗疲勞［7］、降血壓［8］、降血糖［2］和降血脂［9］等功效，已上市的 SPP 類藥品有20多種，如血脂康、地奧血脂康等，其中瑞福康膠囊是中國第一個利用家蠶生產(chǎn)的基因工程口服蛋白質(zhì)藥物［10］。SPP經(jīng)酶水解、精制后所得到的蠶蛹肽能夠參與人體心腦血管系統(tǒng)的代謝，可有效清除血液中多余的膽固醇及脂類物質(zhì)，達(dá)到軟化血管、降低血壓的作用［11］。蠶蛹肽還可應(yīng)用于食品工業(yè)，作為食品添加劑改善觀感，調(diào)節(jié)口味，如用于氨基酸飲料中［12］，并作為食品營養(yǎng)強(qiáng)化劑在營養(yǎng)強(qiáng)化食品中使用［13］。作為寶貴的藥膳同源性昆蟲蛋白資源，近年來，國內(nèi)外在SPP利用方面的研究也取得了突破性的進(jìn)展［2］。鑒于SPP具有降血壓，降血糖、降低膽固醇等功效和免疫調(diào)節(jié)作用，其在特殊醫(yī)學(xué)用途食品的開發(fā)領(lǐng)域中也備受人們重視，為此，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)糖尿病人腸內(nèi)營養(yǎng)(enteral nutrition，EN)制劑的配制要求和質(zhì)量指標(biāo)，將蠶蛹蛋白和蠶蛹短肽(silkworm pupae peptide，SPP)作為EN制劑的蛋白質(zhì)來源，配制成糖尿病人專用的EN制劑，用于觀察該制劑干預(yù)2型糖尿病(Type 2 Diabetes mellitus，T2DM)小鼠代謝特性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF級雄性昆明小鼠 購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司(Slac laboratory animal)，體重在8～11g。動物合格證號:SCXK(滬)2012-0002。

高脂飼料 于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司定制，配方:豬油10%，蛋黃粉10%，膽固醇1%，豬膽鹽 0．2% ，普通飼料 78．8%［14］。

鏈脲佐菌素(STZ) 購于美國 Sigma公司，-20℃保存，用 0．1mol/L，pH4．2～4．5 的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液于冰中避光配制成2%的STZ溶液，0．2μm微孔濾膜過濾滅菌，現(xiàn)配現(xiàn)用。

蠶蛹蛋白質(zhì)粉劑 由江蘇省南通福爾生物制品有限公司提供，生產(chǎn)批號:20130322。分為短肽1型、短肽2型和整蛋白型三種，其中短肽1型、2型樣品是根據(jù)邱英華等［15］雙酶法水解蠶蛹蛋白的方法，由脫脂蠶蛹粉末通過雙酶法(堿性蛋白酶和中性蛋白酶)水解得到蠶蛹短肽樣品，分子量為701．50u，整蛋白型樣品根據(jù)朱新鵬等［16］介紹的堿法提取蠶蛹蛋白的工藝制得白色無味蛋白質(zhì)粉末，分子量為19586．03u，三種樣品的氨基酸組成分析見表 1［17］。

表1 蠶蛹蛋白和蠶蛹短肽樣品的氨基酸組成(g/100g)Table 1 Amino acid composition(g/100g)of three silkworm pupae protein and peptide samples(g/100g)

以SPP粉為蛋白源的自制EN制劑，每100g所含熱量為1968．42kJ，其中蛋白質(zhì)供能比為20%、脂肪供能比為32．6%、碳水化合物供能比為45．7%，含膳食纖維9g(表2)。

表2 雅培益力佳SR與自制腸內(nèi)營養(yǎng)粉劑主要營養(yǎng)成分比較(100g)Table 2 The comparison of main ingredient between Abbott Glucerna SR and SPP Enteral Formula(100g)

雅培益力佳SR營養(yǎng)配方粉 由雅培貿(mào)易(上海)有限公司生產(chǎn)，批號:6932904708741。每100g粉劑含424kcal(1772kJ)能量，其中蛋白質(zhì)供能比為16．30%、脂肪供能比為37．59%、碳水化合物供能比為 42．22% 、含膳食纖維 3．46g。

京都GT-1640快速血糖測定儀 日本ARKRAY Factory，inc生產(chǎn)企業(yè);京都GT-1640血糖試紙 日本國德島縣美馬市脅町大字豬尻字西上野110，生產(chǎn)批號:3H5A4S;壓片機(jī) 由Rimek公司提供，型號:Mini PRESS-ⅡSF;AU5800全自動生化分析儀 貝克曼庫爾特;水沖式籠具型號:M-5型(去底) 購自南京便診生物有限公司;其余設(shè)備均為實(shí)驗(yàn)室常用儀器。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 蠶蛹蛋白源腸內(nèi)營養(yǎng)片劑的制備 將自制(分別以短肽1、短肽2和整蛋白型為蛋白源)腸內(nèi)營養(yǎng)粉劑與市售雅培益力佳粉劑采用壓片機(jī)壓成中心厚度為5～7mm、質(zhì)量約1g左右的片劑。

1．2．2 糖尿病小鼠模型建立 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，隨機(jī)選出10只作為對照組，普通飼料喂養(yǎng)，其余小鼠改用高脂飼料喂養(yǎng)，所有小鼠繼續(xù)喂養(yǎng)3周。第3周末禁食12h(晚9:00開始禁食，自由飲水)過夜左下腹腔注射STZ 40mg/kg BW，正常組注射等體積的0．1mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，各組小鼠同等條件每天注射一次，連續(xù)注射3d。第4周末小鼠再次禁食12h(只禁食不禁水)，尾靜脈取血用快速血糖儀測定空腹血糖值。

1．2．3 實(shí)驗(yàn)小鼠分組及腸內(nèi)營養(yǎng)支持 記錄小鼠攝食量、飲水量，挑選具有多飲、多食、體質(zhì)量下降、血糖值≥11．1mmol/L 的小鼠確定為實(shí)驗(yàn)小鼠［18-20］，共50只，隨機(jī)分為5組，每組10只，分別為A組:空白組;B組:益力佳組，投與以雅培益力佳為蛋白源的EN片劑，每只/片/d;C組:短肽1組，投與蠶蛹短肽1蛋白源EN片劑，每只/片/d;D組:短肽2組，投與蠶蛹短肽2蛋白源EN片劑，每只/片/d及E組:蠶蛹蛋白組，投與以蠶蛹蛋白為蛋白源的EN片劑，每只/片/d，將包括F組(對照組)在內(nèi)的所有小鼠均移至水沖式籠具喂養(yǎng)，小鼠均飲用足量去離子水，保持其環(huán)境干燥、清潔。

各組小鼠采用普通飼料繼續(xù)喂養(yǎng)4周，B、C、D、E四組每天早上9:00點(diǎn)投與對應(yīng)EN片劑一次，其余時間自由飲水、攝食。

1．2．4 小鼠體重及空腹血糖值(FBG)測定 小鼠連續(xù)喂養(yǎng)28d，在給予EN片劑前(0d)，給片劑后7、14、21d和28d將對照組(F組)和糖尿病小鼠組(ABCDE)禁食過夜，只禁食不禁水。于次日早上9:00尾靜脈取血用快速血糖儀測定各組小鼠空腹血糖值(Fasting Blood Glucose，F(xiàn)BG)，并于禁食前一天稱量記錄小鼠體質(zhì)量。

1．2．5 口服葡萄糖耐量(OGTT)實(shí)驗(yàn) 糖尿病小鼠在EN片劑支持21d后，將A-F組小鼠禁食過夜，于第二天早上9:00投與EN片劑(空白組給予普通飼料)，60min后再灌胃給予50mmol/kg葡萄糖，用快速血糖測定儀測定小鼠灌胃前(0min)、灌胃后30、60和120min的血糖值，并計算葡萄糖耐量曲線下面積(Area Under Curve，AUC)(AUC=1/4(0min 血糖值)+1/2(30min血糖值)+3/4(60min血糖值)+1/2(120min血糖值))。

1．2．6 血清生化指標(biāo)的測定 小鼠在EN片劑支持28d后，將各組小鼠禁食(自由飲水)過夜，于次日早上10:00用乙醚迷暈小鼠后背部大動脈取血，加入3．8%檸檬酸鈉溶液抗凝，3000r/min離心5min，取上清液送至上海市第六人民醫(yī)院(東院)用于血清生化指標(biāo)的測定，使用貝克曼庫爾特AU5800全自動生化分析儀檢測包括血清總膽固醇(Total Cholesterol，TC)、甘油三酯(Triglyceride，TG)、高密度脂蛋白(High Density Lipoprotein Cholesterol，HDL)及低密度脂蛋白(Low Density Lipoprotein Cholesterol，LDL)含量，并計算HDL/TC值。

1．2．7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS軟件(19．0版)對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，所有計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，利用LSD法檢驗(yàn)每組間的顯著性差異，p＜0．05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 蠶蛹蛋白腸內(nèi)營養(yǎng)制劑對糖尿病小鼠生活狀態(tài)的影響

對照組小鼠毛色光亮，活動頻繁，飲水?dāng)z食量正常;糖尿病小鼠毛發(fā)枯黃、光澤度下降，精神萎靡，出現(xiàn)多飲、多尿和體重下降，尿液粘度大，糞便呈稀溏狀，下腹部侵濕;食用SPP腸內(nèi)營養(yǎng)片劑支持的 DM小鼠較食用益力佳EN片劑的DM小鼠毛色光澤度高，小鼠活動更為頻繁，墊料相對更為干燥。

2.2 蠶蛹蛋白腸內(nèi)營養(yǎng)制劑對糖尿病小鼠空腹血糖(FBG)的影響

與對照組相比，空白組小鼠FBG水平顯著升高(p＜0．01)，且均高于 11．1mmol/L，說明 STZ 和高脂飼料誘導(dǎo)的小鼠T2DM造模成功。EN制劑支持前后DM小鼠FBG值變化見圖1。

圖1 腸內(nèi)營養(yǎng)制劑支持前后糖尿病小鼠空腹血糖值(FBG)變化Fig．1 Effect of silkworm pupa protein Enteral Formula support on T2DM mice FBG index

空白組小鼠在最初的21d內(nèi)FBG值仍持續(xù)緩慢升高，而實(shí)驗(yàn)組小鼠在對應(yīng)EN片劑支持后FBG值開始下降，短肽1組小鼠在EN支持一周后FBG值明顯下降(p＜0．05)，兩周后下降達(dá)極其顯著水平(p＜0．01)，在第四周小鼠血糖下降至9mmol/L，但各組數(shù)據(jù)組內(nèi)差異較大。益力佳組小鼠血糖在最初一周也有小幅下降，但不顯著且一周后血糖值基本穩(wěn)定在14mmol/L而無下降趨勢。其中，C、D、E 組 FBG 水 平 分 別 降 低 了 47．47%、38．14% 和41．52%，而 B 組僅下降了 22．38%，這表明以 SPP為蛋白源的EN制劑對DM小鼠降血糖功效較市售雅培益力佳更有效，且以短肽1型蛋白源EN制劑效果最為明顯。

表3 EN支持前后糖尿病小鼠口服葡萄糖耐量(OGTT)變化Table 3 Effect of SPP Enteral Formula support on mice OGTT index

表4 蠶蛹蛋白腸內(nèi)營養(yǎng)制劑對糖尿病小鼠血清指標(biāo)的影響Table 4 Effect of SPP Enteral Formula support on T2DM mice Serum biochemical parameters

2.3 蠶蛹蛋白腸內(nèi)營養(yǎng)制劑對糖尿病小鼠口服葡萄糖耐量(OGTT)的影響

在EN片劑支持21d后，各組小鼠口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(表3)，對照組小鼠在灌胃給予50mmol/kg葡萄糖溶液后，其OGTT值在最初30min內(nèi)暫時上升至約9．0mmol/L，30min后血糖值開始下降，直至2h后血糖基本恢復(fù)至灌胃前水平。

與對照組相比，空白組小鼠在灌胃葡萄糖后30min的血糖值大幅升高，且在后續(xù)時間內(nèi)恢復(fù)較慢，在120min時血糖仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于灌胃前血糖值，食用短肽型EN片劑的小鼠較空白組小鼠血糖升高平緩，在灌胃30min后FBG值下降顯著(p＜0．05)，灌胃2h后血糖值基本恢復(fù)至灌胃前血糖值。益力佳組小鼠血糖值在較高水平上也有所下降，但灌胃30min后未出現(xiàn)顯著性，1h后血糖值下降顯著。

2.4 蠶蛹蛋白腸內(nèi)營養(yǎng)制劑對糖尿病小鼠脂代謝的影響

蠶蛹蛋白EN制劑對DM小鼠脂代謝的影響見表4。

以SPP為蛋白源的實(shí)驗(yàn)組在EN制劑支持4周后，TC值顯著降低(p＜0．01)，TG 與 LDL較空白組也有所降低，但無顯著性差異，其中短肽2組表現(xiàn)尤為明顯，該組數(shù)據(jù)在各指標(biāo)中均最小，而益力佳組小鼠各指標(biāo)較空白組除TC外變化均不明顯。HDL在短肽2組中有所下降(表4)，但相對TC的下降幅度要小。

3 結(jié)論與討論

糖尿病是嚴(yán)重危害人類健康的重大疾病，是遺傳因素與環(huán)境因素長期共同作用而導(dǎo)致的一種慢性、全身性、內(nèi)分泌代謝性疾?。?1］。當(dāng)今世界已有DM患者2．46億，中國占有1億患者，居世界之首，患者中以T2DM占主導(dǎo)［22］。胰島素抵抗是T2DM發(fā)病的重要始因，本實(shí)驗(yàn)結(jié)合國內(nèi)外小鼠T2DM造模方法［23，18］，選用高脂飼料模擬肥胖 T2DM 患者發(fā)病初期的胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，再通過多次小劑量注射STZ破壞胰島β細(xì)胞功能，加速DM的發(fā)生，最后誘發(fā)出高血糖癥。這種建模方式成膜率較高(70%)，但多次注射后小鼠各指標(biāo)個體差異較大，以致分組后組內(nèi)數(shù)據(jù)差異較大。

由于高血糖是T2DM的重要特點(diǎn)，長期以來對DM的治療以控制血糖為主要目標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)FBG測定結(jié)果顯示，使用以SPP為蛋白源的EN制劑支持1周后即能顯著降低FBG值，持續(xù)EN支持四周后小鼠血糖值可下降至9～10mmol/L，但實(shí)驗(yàn)組小鼠血糖值仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對照組，這源于本實(shí)驗(yàn)在使用EN支持的同時，并未給小鼠胰島素注射或使用降血糖的藥物，EN支持制劑只能起到有效控制餐后或空腹血糖值、調(diào)節(jié)血脂代謝的效果，只是輔助營養(yǎng)治療而并不能代替藥物起到治療DM的作用。

近年來隨著對DM認(rèn)識的深化，發(fā)現(xiàn)葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)對于臨床診斷DM十分重要，是否改善糖耐量是評價藥物藥效的一個重要手段［24］。本實(shí)驗(yàn)中口服葡萄糖耐量(OGTT)測量結(jié)果表明:給予以蠶蛹短肽1或蠶蛹短肽2為蛋白源EN制劑的小鼠在灌胃30min后血糖有小幅上升，而后顯著下降，在灌胃2h后小鼠血糖值基本恢復(fù)到灌胃前，這較益力佳組有更好的葡萄糖耐受度。

T2DM患者還常伴有脂代謝紊亂，表現(xiàn)為TG升高、HDL-C降低、LDL-C升高或正常，為此血脂代謝狀況也是評價T2DM病人病情的重要指標(biāo)［21］。本實(shí)驗(yàn)中，DM空白組小鼠即出現(xiàn)了高血脂癥及血脂代謝紊亂。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SPP蛋白源EN制劑明顯降低了糖尿病小鼠的TC、TG及LDL水平。但本實(shí)驗(yàn)使用的外源性引起的T2DM小鼠高血脂模型與人類內(nèi)源性DM高血脂模型存在一定的差異，因此本實(shí)驗(yàn)中自制EN制劑對血脂不同成分的影響及機(jī)理需要進(jìn)一步研究。

［1］Ji K M，Zhan Z K，Chen J J，et al．Anaphylactic shock caused by silkworm pupa consumption in China［J］．Allergy，2008，63(10):1407-1408．

［2］Yang Y，Tang L，Tong L，et al．Silkworms culture as a source of protein for humans in space［J］．Advances in Space Research，2009，43(8):1236-1242．

［3］FAO/WHO．Energy and Protein Requirements［R］．FAO/WHO，Rome，Italy．1973．

［4］Zhou J，Han D．Proximate，amino acid and mineral composition of pupae of the silkworm．Antheraea pernyi in China［J］．Journal of food composition and analysis，2006，19(8):850-853．

［5］Xu H，Hao W，He D，et al．Smt3 is required for the immune response of silkworm，Bombyx mori［J］．Biochimie，2010，92(10):1306-1314．

［6］Hu D，Liu Q，Cui H，et al．Effects of amino acids from selenium-rich silkworm pupas on human hepatoma cells［J］．Life sciences，2005，77(17):2098-2110．

［7］Wen H，Chang Y，Cao B．Anti-fatigue function of silkworm pupa protein polypeptides［J］．Food Science，2009，30(19):291-293．

［8］Igarashi K，Yoshioka K，Mizutani K，et al．Blood pressuredepressing activity of a peptide derived from silkworm fibroin in spontaneously hypertensive rats［J］．Bioscience，biotechnology，and biochemistry，2006，70(2):517-520．

［9］Sheng S，Zhou J，Shen Y，et al．Effect of Honeybee Pupae Peptide-rich Protein Powder on Immune Function，Blood Glucose and Blood Lipid in Rats［J］．Food Science，2010，3:057．

［10］Hong-xin W．Progress in the study on bioactive ingredient of silkworm pupa［J］．Qilu Pharmaceutical Affairs，2007，6:022．

［11］陳靜，鄭明珠，王浩．蠶蛹蛋白肽的制備及其運(yùn)動飲料研制［J］．食品科學(xué)，2009(14):318-320．

［12］于小磊，耿麗晶，郭雪松，等．雙酶水解蠶蛹蛋白制備氨基酸飲料的研究［J］．中國農(nóng)學(xué)通報，2013，29(27):195-199．

［13］Zhou J，Han D．Safety evaluation of protein of silkworm(Antheraea pernyi)pupae［J］．Food and chemical toxicology，2006，44(7):1123-1130．

［14］Luo J，Quan J，Tsai J，et al．Nongenetic mouse models of non-insulin-dependent diabetes mellitus［J］．Metabolism，1998，47(6):663-668．

［15］朱新鵬，張恒瑞．蠶蛹蛋白雙酶法水解工藝優(yōu)化［J］．湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，51(5):2081-2084．

［16］邱英華，孫衛(wèi)東，王玉海，等．蠶蛹蛋白提取與脫臭工藝研究［J］．中國食品添加劑，2012，3:133-136．

［17］陳佳捷，吳文惠，倪玲，等．蠶蛹蛋白和蠶蛹短肽的模擬胃/腸道消化特性研究［J］．食品工業(yè)科技，2014，35(1):333-337．

［18］Gilbert E R，F(xiàn)u Z，Liu D．Development of a nongenetic mouse model of type 2 diabetes［J］．Experimental diabetes research，2011，2011:1-12．

［19］楊強(qiáng)．白藜蘆醇減輕2型糖尿病小鼠心肌缺血/再灌注損傷及機(jī)制［D］．西安:第四軍醫(yī)大學(xué)，2012:1-66．

［20］Fu Z，Zhang W，Zhen W，et al．Genistein induces pancreatic β-cell proliferation through activation of multiple signaling pathways and prevents insulin-deficient diabetes in mice［J］．Endocrinology，2010，151(7):3026-3037．

［21］顧景范，杜壽玢，郭長江．現(xiàn)代臨床營養(yǎng)學(xué)．北京:科學(xué)出版社，2009:529-543．

［22］魯琳:“世界糖尿病日:20歲以上患病率為9．7% 年輕人比 例 上 升 ”．http://sh．eastday．com/m/20131114/u1a7774399．html(2013/11/14)

［23］王彤，周國用，湯秀群，等．鏈脲佐菌素和高脂肪飼料誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性2型糖尿病小鼠模型［J］．中國糖尿病雜志，2000，8(2):111-112．

［24］Herman G A，Bergman A，Stevens C，et al．Effect of single oral doses of sitagliptin，a dipeptidyl peptidase-4 inhibitor，on incretin and plasma glucose levels after an oral glucose tolerance test in patients with type 2 diabetes［J］．Journal of Clinical Endocrinology ＆ Metabolism，2006，91(11):4612-4619．