包裹RuBpy二氧化硅熒光納米探針的制備及其用于肝癌細(xì)胞的識(shí)別

陳敏艷+陳澤忠+王維+朱+鏈+唐宏武++龐代文

摘 要 制備了兩種不同官能團(tuán)修飾的偶聯(lián)親和素的包裹釕聯(lián)吡啶（RuBpy）二氧化硅熒光納米探針A和探針B，并分別用于肝癌細(xì)胞的識(shí)別。通過(guò)反相微乳液法制備得到表面修飾不同官能團(tuán)的納米顆粒，然后通過(guò)親和素與羧基化包裹RuBpy二氧化硅納米顆粒相互連接而制備得到探針A；通過(guò)親和素與PEG修飾的熒光二氧化硅納米顆粒相互作用而制備得到探針B。與探針A不同的是，探針B 通過(guò)一個(gè)長(zhǎng)鏈PEG分子將親和素與熒光二氧化硅納米顆粒偶聯(lián)在一起。利用免疫熒光成像法將這兩種探針?lè)謩e用于人肝癌細(xì)胞的識(shí)別，結(jié)果表明，含有長(zhǎng)鏈PEG分子的探針B更能夠有效地識(shí)別肝癌細(xì)胞表面腫瘤標(biāo)志物癌胚抗原（CEA）。

關(guān)鍵詞 二氧化硅熒光納米顆粒； 生物偶聯(lián)； 肝癌細(xì)胞； 癌胚抗原

1 引 言

隨著納米技術(shù)的迅猛發(fā)展，各種各樣的納米材料已被廣泛應(yīng)用于生物分析、物質(zhì)分離、疾病診斷和治療等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。熒光納米材料，如半導(dǎo)體熒光量子點(diǎn)、碳點(diǎn)和包裹染料的二氧化硅納米顆粒等，通過(guò)表面偶聯(lián)生物功能分子（如抗體或適配體）后，形成具有靶向功能的熒光納米探針，從而應(yīng)用于高靈敏的生物分析[1～7]。生物分析最常用的標(biāo)記材料是有機(jī)熒光分子，但具有易光漂白、生物相容性較差等缺點(diǎn)，極大地限制了其應(yīng)用。為了克服有機(jī)熒光染料的上述缺點(diǎn)，開(kāi)發(fā)具有光穩(wěn)定性的熒光標(biāo)記材料，成為人們關(guān)注的目標(biāo)。二氧化硅復(fù)合熒光納米顆粒不僅具有良好的生物相容性、表面易修飾、抗光漂白性、低成本、易分離和良好親水性等優(yōu)點(diǎn)[8，9]，而且能夠使核酸酶遠(yuǎn)離固定在其表面的DNA分子，從而保護(hù)DNA免受核酸酶的降解[10～12]。由于抗體能與抗原特異性結(jié)合，目前已有研究將抗體分子偶聯(lián)到二氧化硅納米顆粒制備具有靶向性的熒光納米探針，并將其用于細(xì)菌檢測(cè)、癌細(xì)胞識(shí)別和抗原檢測(cè)等方面[13～17]。

癌胚抗原（CEA）是一種分子量為180～200 kDa 的多糖蛋白復(fù)合物，屬于腫瘤細(xì)胞表面的結(jié)構(gòu)抗原。CEA 作為一種最常見(jiàn)的腫瘤標(biāo)志物， 被廣泛用作各種消化系腫瘤的診斷及監(jiān)測(cè)指標(biāo)[18]。免疫標(biāo)記成像法是一種常見(jiàn)的原位檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物的方法，它通過(guò)研究細(xì)胞膜或細(xì)胞內(nèi)部特定生物化學(xué)參數(shù)的變化與差異來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別與檢測(cè)，操作簡(jiǎn)單、結(jié)果直觀(guān)，在癌癥的診斷和轉(zhuǎn)移研究領(lǐng)域具有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)以肝癌細(xì)胞膜表面CEA為靶標(biāo)，將包裹釕聯(lián)吡啶（RuBpy）的二氧化硅復(fù)合熒光納米顆粒表面生物功能化，制備成可進(jìn)行生物標(biāo)記的納米探針，分別用于肝癌細(xì)胞LM 9、Huh 7的識(shí)別與成像。與染料分子相比，帶正電荷的RuBpy分子通過(guò)靜電作用能夠被穩(wěn)定地束縛在帶有負(fù)電荷的二氧化硅矩陣?yán)铮趸铓拥谋Ｗo(hù)使自由氧不能接近熒光染料分子。同時(shí)，大量的染料分子被包裹在二氧化硅納米顆粒核內(nèi)，從而起到信號(hào)放大的作用[19～21]。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

二氧化硅納米顆粒形貌及粒徑采用日本JEM100CXII 型透射電鏡進(jìn)行測(cè)定；官能團(tuán)表征采用美國(guó)Nicolet 5700 型紅外光譜儀測(cè)量；細(xì)胞成像采用Nikon ECLIPSE TE2000 U 熒光倒置顯微鏡。

曲拉通（Triton X 100）、環(huán)己烷、正己醇、氨水、正硅酸四乙酯（TEOS）、羧基乙基硅烷三醇鈉鹽（CEOS）、＼[羥基 （聚乙二醇） 丙基] 三乙氧基硅烷（HPEOPES）、1 乙基 （3 二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、N羥基硫代琥珀酰亞胺（Sulfo NHS）、親和素（Avidin）、2 （N嗎啡啉乙磺酸（MES）、釕聯(lián)吡啶 （Rubpy），均購(gòu)于Sigma公司；人肝癌LM 9細(xì)胞株由武漢大學(xué)中南醫(yī)院提供；人肝癌Huh 7 細(xì)胞株購(gòu)于中國(guó)典型物培養(yǎng)中心；其它試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水均采用三次蒸餾水。

2.2 表面官能團(tuán)修飾的二氧化硅熒光納米顆粒合成

包裹染料的二氧化硅納米顆粒合成采用油包水（W/O）的反相微乳法[22]。首先取1.77 mL Triton X 100、7.5 mL環(huán)己烷、1.6 mL 正己醇和400 μL水，于室溫下磁力攪拌10 min后形成微乳體系；在此體系中加入80 μL 濃度為 0.1mol/L釕聯(lián)吡啶溶液，攪拌5 min，加入100 μL TEOS 攪拌30 min后再加入60 μL 氨水在室溫下攪拌用于引發(fā)形成核殼結(jié)構(gòu)。24 h 后，向體系中加入50 μL TEOS和50 μL CEOS，在室溫下進(jìn)一步攪拌12 h 可以得到羧基修飾的二氧化硅納米顆粒（RSiNPs COOH）；而PEG修飾的二氧化硅納米顆粒（RSiNPs PEG）則加入100 μL TEOS和100 μL HPEOPES。當(dāng)反應(yīng)完成時(shí)，用丙酮破乳，最后分別用乙醇和水離心洗滌3次，將得到的納米顆粒經(jīng)真空冷凍干燥后備用。

2.3 親和素修飾的二氧化硅熒光納米探針的制備

2.3.1 探針A 的制備 將1 mg EDC、2.5 mg Sulfo NHS和1 mg 羧基修飾的納米顆粒一起加入到 1 mL 0.1 mol/L MES 緩沖液中， 并在室溫下活化反應(yīng)15 min。整個(gè)溶液經(jīng)離心洗滌后重新分散在1 mL PBS緩沖液（pH 7.4）中，立即加入50 μL 1 g/L 親和素后， 在室溫下置于搖床反應(yīng)2 h，隨后向溶液中加入100 μL 含有2% 牛血清蛋白的PBS緩沖液封閉1 h。待反應(yīng)完成后，經(jīng)離心洗滌后親和素修飾的納米顆粒被重新分散在PBS緩沖液（pH 7.4）中，并在4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.2 探針B 的制備

將1 mg PEG修飾的納米顆粒分散到1 mL 2 mol/L Na2CO3緩沖液中，充分混勻后，立即加入1 mL 溴化氰的乙腈溶液（0.8 g/mL），室溫下攪拌15 min，經(jīng)活化的納米顆粒用冰水和PBS緩沖液（pH 7.4）各洗2次后，分散到1mL PBS緩沖液，立即向溶液中加入50 μL 1 mg/mL 親和素，置于4 ℃ 反應(yīng)24 h， 待反應(yīng)完成后加入100 μL 含有2% 牛血清蛋白的PBS緩沖液，在4 ℃過(guò)夜。經(jīng)過(guò)反復(fù)離心洗滌后親和素修飾的納米顆粒被重新分散在PBS緩沖液（pH 7.4）中，并在4 ℃下保存?zhèn)溆谩?

2.4 肝癌細(xì)胞的培養(yǎng)與識(shí)別

2.4.1 肝癌細(xì)胞的培養(yǎng) 將肝癌細(xì)胞LM 9、Huh 7用DMEM培養(yǎng)基（含10%小牛血清、100 mg/L鏈霉素和100 mg/L青霉素）吹散，于5% CO2、 37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞鋪滿(mǎn)培養(yǎng)瓶底部90%時(shí)，用1 mL 1%胰蛋白酶消化液處理細(xì)胞1～3 min，待細(xì)胞脫離培養(yǎng)瓶壁，加入9 mL DMEM培養(yǎng)基，待細(xì)胞吹勻后將其平均分裝在兩個(gè)培養(yǎng)瓶中。取一定體積的細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)到50%～80%時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)與傳代時(shí)所用器皿及試劑均進(jìn)行過(guò)高壓滅菌或過(guò)濾除菌。

2.4.2 肝癌細(xì)胞LM 9的識(shí)別

分別取100 μL探針A和探針B到已固定好LM 9細(xì)胞的培養(yǎng)板中，并在每孔補(bǔ)加100 μL PBS緩沖液（pH 7.4）置于37 ℃ 下孵育2 h，孵育完成后，再用PBS緩沖液洗滌3次， 以除去沒(méi)有反應(yīng)的探針。對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組操作的區(qū)別在于前者不加兔抗CEA抗體。

2.4.3 肝癌細(xì)胞Huh 7的識(shí)別

取100 μL探針B到已固定好Huh 7細(xì)胞的培養(yǎng)板中，并在每孔補(bǔ)加100 μL PBS緩沖液（pH 7.4）置于37 ℃ 下孵育2 h，孵育完成后，再用PBS緩沖液洗滌3次， 以除去沒(méi)有反應(yīng)的探針。對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組操作的區(qū)別在于前者不加兔抗CEA抗體。

3 結(jié)果與討論

3.1 二氧化硅熒光納米顆粒大小形貌表征

采用透射電鏡對(duì)合成的羧基和PEG修飾的二氧化硅的進(jìn)行了表征，從圖1可見(jiàn)，羧基和PEG修飾納米顆粒都有很均一的尺寸，粒徑約為60 nm。此外，通過(guò)高分辨電鏡可以明顯地觀(guān)察到包裹熒光染料二氧化硅納米顆粒的核殼結(jié)構(gòu)。

3.2 熒光光譜和紅外表征

實(shí)驗(yàn)表明，熒光染料RuBpy溶液的熒光發(fā)射光譜的最大發(fā)射波長(zhǎng)為610 nm，本研究制備的兩種包裹RuBpy的熒光納米顆粒RSiNPs COOH和RSiNPs PEG均發(fā)射明亮的紅色熒光，其最大發(fā)射波長(zhǎng)分別為609和610 nm。因此，二氧化硅基本上不影響RuBpy的熒光發(fā)射光譜。

通過(guò)紅外光譜對(duì)二氧化硅球表面的官能團(tuán)進(jìn)行了證實(shí)，結(jié)果如圖2所示。 特征峰歸屬如下： 3400 cm

Symbolm@@ 1左右的為OH的反對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)和對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)，1100 cm

Symbolm@@ 1附近的吸收峰為亞甲基的伸縮振動(dòng)，證明二氧化硅復(fù)合納米顆粒表面已分別成功修飾上了羧基和PEG。

3.3 肝癌細(xì)胞識(shí)別和成像

采用間接免疫熒光法對(duì)肝癌細(xì)胞表面的CEA進(jìn)行標(biāo)記，并通過(guò)抗原 抗體、生物素 親和素之間的特異性結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)的免疫熒光標(biāo)記成像，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)肝癌細(xì)胞的識(shí)別。分別使用RSiNPs COOH、RSiNPs PEG作為信號(hào)指示探針對(duì)肝癌細(xì)胞LM 9表面的CEA進(jìn)行標(biāo)記。

為了考察納米探針是通過(guò)抗原抗體特異性靶向模式與肝癌細(xì)胞結(jié)合，還是通過(guò)非特異性吸附于肝癌細(xì)胞表面，設(shè)置了對(duì)照組實(shí)驗(yàn)：以PBS代替兔抗CEA抗體IgG。探針A和探針B對(duì)LM 9中CEA的標(biāo)記結(jié)果如圖3所示。

在探針A對(duì)細(xì)胞的識(shí)別實(shí)驗(yàn)組中，在熒光圖像中可觀(guān)察到部分肝癌細(xì)胞LM 9表面發(fā)出了紅色熒光，而在明場(chǎng)和熒光的疊加圖像中，部分細(xì)胞并未發(fā)出紅色的熒光，這可能是因?yàn)樘结楢與細(xì)胞之間存在空間位阻，僅有部分細(xì)胞被標(biāo)記。而在探針B的識(shí)別實(shí)驗(yàn)組中，熒光顯微鏡下可觀(guān)察到絕大部分肝癌細(xì)胞LM 9表面發(fā)出了強(qiáng)烈的紅色熒光，在明場(chǎng)和熒光場(chǎng)的疊加圖中絕大部分的細(xì)胞均發(fā)出了紅色熒光，說(shuō)明了肝癌細(xì)胞LM 9表面結(jié)合了大量的探針B。在相應(yīng)的對(duì)照組中，肝癌細(xì)胞幾乎沒(méi)有熒光信號(hào)，說(shuō)明探針B與肝癌細(xì)胞之間無(wú)明顯的非特異性吸附。這表明探針B是以抗體 抗原結(jié)合模式結(jié)合到肝癌細(xì)胞表面的，同時(shí)也說(shuō)明在avidin與PRSiNPs之間的PEG分子，極大地提高了Avidin分子的自由度和活性[23，24]。

上述方法具有普適性，基于相同模式，在理論上可以用于多數(shù)癌細(xì)胞的標(biāo)記。為了進(jìn)一步證明這種間接免疫熒光法的普適性， 使用探針B對(duì)另一種肝癌細(xì)胞Huh 7的表面CEA進(jìn)行了標(biāo)記，結(jié)果如圖4所示。

在熒光顯微鏡下可觀(guān)察到實(shí)驗(yàn)組的肝癌細(xì)胞Huh 7表面發(fā)出強(qiáng)烈的紅色熒光，說(shuō)明肝癌細(xì)胞Huh 7表面結(jié)合了大量探針B。同時(shí)，在對(duì)照組中，肝癌細(xì)胞上幾乎未觀(guān)察到熒光信號(hào)，說(shuō)明探針B與肝癌細(xì)胞之間無(wú)明顯非特異性吸附。明場(chǎng)和熒光的疊加圖像清楚地表明該探針對(duì)癌細(xì)胞具有很高的識(shí)別效率。因此，基于探針B的間接免疫熒光法具有較好的普適性。

4 結(jié) 論

制備了羧基和PEG修飾的包裹釕聯(lián)吡啶二氧化硅熒光納米顆粒，設(shè)計(jì)了兩種用親和素修飾的二氧化硅熒光納米探針， 并對(duì)肝癌LM 9細(xì)胞標(biāo)記，結(jié)果表明：表面修飾PEG分子的納米探針能有效地識(shí)別癌細(xì)胞表面靶蛋白，從而實(shí)現(xiàn)癌細(xì)胞的識(shí)別和檢測(cè)。采用此探針成功地對(duì)肝癌Huh 7細(xì)胞進(jìn)行了識(shí)別，并驗(yàn)證了該方法的普適性。

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