基于金納米粒子的動態(tài)光散射法檢測溶液中的汞離子

馬立娜+劉殿駿+王振新

摘 要 發(fā)展了一種基于汞離子（Hg2+）適配體（Aptamer）免標記金納米粒子的動態(tài)光散射（DLS）法，用于靈敏、選擇性的檢測溶液中的Hg2+。Aptamer 5′ TTTCTTCTTTCTTCCCCCCTTGTTTGTTGTTT 3′與Hg2+的特異性結合使金納米粒子失去保護，在含有100 mmol/L NaCl的緩沖溶液中發(fā)生聚集，金納米粒子的平均水合粒徑變大。在pH=7.43，110 nmol/L Aptamer ，100 mmol/L NaCl，Hg2+與Probe DNA孵育時間為30 min的實驗條件下，金納米粒子水合粒徑的變化值（

SymbolDA@ D）與Hg2+的濃度成正比。檢出Hg2+的線性范圍為0.1 nmol/L～5 μmol/L，檢出限達0.1 nmol/L。湖水及礦泉水兩種水樣加標實驗表明本方法能夠用于實際水樣中Hg2+的檢測。

關鍵詞 汞離子； 動態(tài)光散射（DLS）； 汞離子適配體（Aptamer）； 金納米粒子

1 引 言

作為全球性環(huán)境污染物，汞具有致畸、致癌作用，是蓄積性毒物，對人體健康危害嚴重[1]。常用的汞檢測方法有冷原子吸收光譜法（CAAS）[2]、電感耦合等離子體質譜法（ICP MS）[3]、冷原子熒光光譜法（CAFS）[4]等，這些方法的優(yōu)點是準確度比較高，缺點是均依賴大型儀器，成本比較高，需要熟練的操作人員，預處理過程繁瑣耗時，不能滿足環(huán)境監(jiān)測中高效低成本的需要。

近年研究發(fā)現(xiàn)，Hg2+能介導胸腺嘧啶（T）配對，形成穩(wěn)定的T Hg2+ T特異性結構[5]。金納米粒子（GNPs）具有較高的摩爾消光系數(shù)，大的比表面積，與粒子形狀、大小、聚集程度以及粒子之間距離相關的光學性質等特點[6]，可設計一系列生化反應以改變GNPs間的距離，從而實現(xiàn)對靶標物質的檢測?？蓪NPs的光學特性和T Hg2+ T特異性結構相結合用于檢測Hg2+＼[7，8]，該類方法的特異性強、操作簡單。

動態(tài)光散射技術（Dynamic light scattering， DLS），是指通過測量樣品散射光強度變化得出樣品顆粒大小信息的一種技術。這種方法測量過程不干擾樣品本身的性質，能夠反映出溶液中樣品分子的真實狀態(tài)，測量過程迅速，檢測靈敏度高，能夠實時監(jiān)測樣品的動態(tài)變化。目前，這種方法已經(jīng)被應用于檢測金屬離子[9，10]和癌癥標記物[11]等。本研究結合GNPs的光學特性和T Hg2+ T特異性結構，運用DLS的方法檢測溶液中的Hg2+，比文獻＼[7]靈敏度提高了3個數(shù)量級，且方法具有較好的選擇性。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Zetasizer Nano ZS 90動態(tài)光散射粒度儀（DLS，英國Malvern公司）用于測量粒子的水合粒徑，實驗操作條件為：溫度25 ℃，散射角度90°，激光器波長633 nm； Mini 1240型紫外 可見分光光度計（日本Shimadzu公司）； iCAP 6300型電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀（ICP AES， 美國Thermo公司）； H600型透射電子顯微鏡（TEM，日本Hitachi公司）。氯金酸（HAuCl4·3H2O，Sigma Aldrich公司）。DNA（上海生工生物工程有限公司），Hg2+ aptamer（Probe DNA）序列如下：5′ TTTCTTCTTTCTTCCCCCCTTGTTTGTTGTTT 3′，對照DNA（Control DNA）序列如下：5′ AAACGGCAAAACATCCCCCCAAGTAAGAAGAAA 3′[12]，DNA的濃度由260 nm處測得的紫外吸光度確定，其消光系數(shù)等于鏈中所含各堿基的摩爾消光系數(shù)之和。4 羥乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPEs，北京鼎國生物技術有限責任公司），乙二胺四乙酸二鈉鹽（EDTA），NaCl，NaOH，Al2（SO4）3·18H2O，MgCl2·6H2O，CaCl2，BaCl2·2H2O，ZnCl2，CuSO4·5H2O，CoCl2·6H2O，3CdSO4·8H2O，F(xiàn)e2（SO4）3，Pb（CH3COO）2，Hg（NO3）2·H2O及其它實驗用試劑均為分析純試劑，購于北京化工廠。實驗用水為Milli Q （18.2 MΩ cm）超純水。

2.2 金納米粒子的制備

按照Frens Turkevich方法[13，14]合成金納米粒子。取100 mL 超純水置于250 mL三頸瓶中，冷凝回流及磁力攪拌下油浴加熱至沸騰；取1% 氯金酸溶液2 mL加入到三頸瓶中，溶液變?yōu)闇\黃色。在氯金酸的沸騰溶液中，迅速加入1% 檸檬酸鈉溶液8 mL，溶液顏色先變?yōu)樯n白色，隨后變?yōu)樗{色，最后變?yōu)樯罴t色。繼續(xù)攪拌加熱30 min，緩慢冷卻至室溫，置于細口瓶中備用。

2.3 金屬離子檢測

將4 μL 10 μmol/L Probe DNA先與180 μL含有不同濃度Hg2+的HEPEs緩沖溶液（100 mmol/L，pH 7.43）反應30 min，加入200 μL GNPs繼續(xù)反應10 min后，加入適量NaCl溶液，使溶液的總體積為400 μL， NaCl最終濃度為100 mmol/L。加入NaCl 3 min后測GNPs水合粒徑。以相同濃度的Control DNA與Hg2+作用為對照實驗。實驗平行測定3次。

2.4 EDTA恢復實驗

將4 μL 10 μmol/L Probe DNA與180 μL 500 nmol/L Hg2+反應30 min，再加入不同濃度的EDTA及3 μL 1 mmol/L NaOH溶液反應30 min，繼續(xù)加入200 μL GNPs反應10 min后，加入適量NaCl溶液，使NaCl的最終濃度為100 mmol/L，溶液的總體積為400 μL。加入NaCl 3 min后測GNPs水合粒徑。

3 結果與討論

3.1 金納米粒子的表征

紫外可見吸收光譜法測得所合成的GNPs的最大吸收峰為520 nm，GNPs粒徑的TEM表征結果為（14.0±1.5） nm，DLS表征結果為（24.2±0.5） nm。因為DLS測得的是GNPs的水合粒徑，TEM則直接測得金核的大小，所以DLS的表征結果高于TEM的表征結果[15]。

3.2 檢測原理

Fig.1 Schematic representation of label free gold nanoparticles （GNP） based dynamic light scattering （DLS） assay for Hg2+ detection并且取決于Probe DNA的構象和方位性。由于GNPs的靜電吸引力，Probe DNA發(fā)生瞬間結構變化，堿基朝著GNPs，不可逆的吸附在GNPs上。因Probe DNA分子間的靜電排斥作用，在較高離子強度時，GNPs依然能夠保持單分散狀態(tài)，此時測得的GNPs水合粒徑以D0表示。當溶液中存在Hg2+時，由于Hg2+和Probe DNA介導配對形成T Hg2+ T特異性結構的能力大于Probe DNA與GNPs之間的作用力，從而導致Probe DNA自身彎折形成雙鏈結構，從GNPs表面脫離，在較高離子強度下，無保護的GNPs易發(fā)生團聚，使GNPs的水合粒徑變大[16，17]，此時測得的GNPs水合粒徑以D表示。Hg2+ aptamer與Hg2+間特定專一的相互作用，使得本方法具有良好的選擇性。

3.3 實驗條件的優(yōu)化

為獲得最佳的實驗結果，考察了溶液pH值，Probe DNA濃度，NaCl濃度以及Hg2+與Probe DNA孵育時間對Hg2+檢測結果的影響。以GNPs水合粒徑的

SymbolDA@ D值（

SymbolDA@ D=D-D0）作為考察體系聚集程度的標準。如圖2所示，在pH 7.43，Probe DNA濃度為110 nmol/L，NaCl濃度為100 mmol/L，Hg2+與Probe DNA孵育時間為30 min時，

SymbolDA@ D值最大。以后的Hg2+檢測實驗均在此優(yōu)化條件下進行。

圖2 （a）不同pH值，（b）不同Probe DNA濃度，（c）不同NaCl濃度，和（d）不同的Hg2+與Probe DNA孵育時間對

SymbolDA@ D的影響

SymbolDA@ D與Hg2+濃度關系曲線，插圖為Hg2+濃度校正曲線

Fig.3 Plot of

SymbolDA@ Dand concentration of Hg2+. The inset is the calibration curve for Hg2+

3.4 Hg2+的測定

在優(yōu)化的實驗條件下對Hg2+進行了檢測，如圖3所示。隨著Hg2+的濃度變大，

SymbolDA@ D值逐漸增大。以Hg2+濃度的對數(shù)與

SymbolDA@ D作圖，得到Hg2+濃度校正曲線。線性范圍為0.1 nmol/L～5 μmol/L，線性相關系數(shù)R2=0.99。方法的檢出限0.1 nmol/L（3S，S為對照實驗經(jīng)20次測量得到的標準偏差）[18]遠低于世界衛(wèi)生組織（WHO）和美國環(huán)境保護局（EPA）規(guī)定的飲用水中Hg2+含量標準2.0 μg/L（10 nmol/L）及6.0 μg/L（30 nmol/L）[19，20]，說明本方法滿足對實際水樣中Hg2+的檢測要求。

圖4為在不同濃度的Hg2+存在下GNPs的TEM圖。溶液中不存在Hg2+時， GNPs呈單分散狀態(tài)（圖4a）； 1 nmol/L Hg2+存在時， 有明顯的聚集體形成（圖4b）； 隨著Hg2+濃度增大， GNPs聚集程度逐漸增加（圖4c，4d）。 TEM表征結果證明Hg2+的存在引起了GNPs聚集。這與DLS的表征結果一致。

圖4 （a） 0，（b） 1，（c） 10，和（d） 100 nmol/L Hg2+存在下GNPs的TEM表征圖

Fig.4 TEM micrographs of GNPs in the presence of （a） 0， （b） 1， （c） 10， and （d） 100 nmol/L Hg2+， respectively

3.5 EDTA恢復實驗

向溶液中依次加入EDTA和NaOH，如圖5所示，

SymbolDA@ D值顯著降低。這是因為在堿性條件下，EDTA作為強的金屬離子螯合劑，能夠與Hg2+配位形成更加穩(wěn)定的配合物，破壞了T Hg2+ T特異結構，從而使Probe DNA恢復自由狀態(tài)并與GNPs作用，使GNPs在較高離子強度下保持單分散狀態(tài)。本實驗進一步證實，由于Hg2+與其適配體的特異性結合而使GNPs失去Probe DNA的保護，在較高離子強度下發(fā)生聚集，GNPs水合粒徑變大。

3.6 方法選擇性的考察

3.7 實際水樣中Hg2+的檢測

為了證明本方法的實用性，使用本方法對某湖水和礦泉水兩種水樣進行加標實驗。使用0.22 μm濾膜處理湖水樣品。結果如表1所示，檢測結果與傳統(tǒng)的電感耦合等離子體質譜法（ICP AES）所測數(shù)據(jù)有很好的一致性，證明本方法能應用于實際水樣中Hg2+的檢測。本方法具有簡單、選擇性好、靈敏度高和較寬線性范圍等優(yōu)點。

References

1 Tchounwou P B， Ayensu W K， Ninashvili N， Sutton D.Environ. Toxicol.，2003， 18（3）： 149-175

2 Harris H H， Pickering I J， George G N.Science， 2003， 301（5637）： 1203-1203

3 XU Jin Yong， WANG Tong， CHEN Du Jun， YE Long Hui， NI Shi Jun.Chinese J. Anal. Chem.， 2012， 40（1）： 169-172

徐進勇， 王 彤， 陳杜軍， 葉隆慧， 倪師軍. 分析化學， 2012， 40（1）： 169-172

4 SHI Jie， ZHU Yong Qin， GONG Xue Yun.Spectroscopy and Spectral Analysis， 2004， 24（7）： 893-895

石 杰， 朱永琴， 龔雪云. 光譜學與光譜分析， 2004， 24（7）： 893-895

5 Nendza M， Herbst T， Kussatz C，Gies A.Chemosphere， 1997， 35（9）： 1875-1878

6 Mansy S， Tobias R S.Inor. Chem.， 1975， 14（2）： 287-291

7 MA Li Na，LIU Dian Jun，WANG Zhen Xin.Chinese J. Anal. Chem.， 2010， 38（1）： 1-7

馬立娜， 劉殿駿， 王振新. 分析化學， 2010， 38（1）： 1-7

8 Wang Y， Yang F， Yang X R.Biosens. and Bioelectro.， 2010， 25（8）： 1994-1998

9 Li D， Wieckowska A， Willner I.Angew. Chem. Int. Edit.， 2008， 47（21）： 3927-3931

10 Xiong C， Ling L S.Talanta ， 2012， 89： 317-321

11 Miao X M， Ling L S， Shuai X T.Anal. Biochem.， 2012， 421（2）： 582-586

12 Liu X， Dai Q， Austin L， Coutts J， Knowle G， Zou J H， Chen H， Huo Q.J. Am. Chem. Soc.，2008， 130（9）： 2780-2782

13 Jiang Z L， Fan Y Y， Chen M L， Liang A H， Liao X J， Wen G Q， Shen X C， He X C， Pan H C， Jiang H S.Anal. Chem.，2009， 81（13）： 5439-5445

14 Turkevich J， Stevenson P C， Hillier J.Discuss. Faraday Soc.，1951， 11： 55-75

15 Frens G.Nature Phys. Sci.， 1973， 241（105）： 20-22

16 Sikkema F D， Comellas Aragonès M， Fokkink R G， Verduin B J M， Cornelissen J J L M， Nolte R J M.Org. Biomol. Chem.，2007， 5（1）： 54-57

17 Rothberg L J， Li H X.J. Am. Chem. Soc.，2004， 126（35）： 10958-10961

18 Wang L H， Liu X F， Hu X F.Chem. Commun.，2006， （36）： 3780-3782

19 Li X K， Wang J E， Sun L L， Wang Z X.Chem. Commun.，2010， 46（6）： 988-990

20 WHO Guidelines for Drinking water Quality.World Health Organization， 4th edn， 2011

21 EPA， U.S.， Drinking Water Contaminants， http：//water.epa.gov/drink/contaminants/index.cfm#List， Accessed on 31 12 11

2 Harris H H， Pickering I J， George G N.Science， 2003， 301（5637）： 1203-1203

3 XU Jin Yong， WANG Tong， CHEN Du Jun， YE Long Hui， NI Shi Jun.Chinese J. Anal. Chem.， 2012， 40（1）： 169-172

徐進勇， 王 彤， 陳杜軍， 葉隆慧， 倪師軍. 分析化學， 2012， 40（1）： 169-172

4 SHI Jie， ZHU Yong Qin， GONG Xue Yun.Spectroscopy and Spectral Analysis， 2004， 24（7）： 893-895

石 杰， 朱永琴， 龔雪云. 光譜學與光譜分析， 2004， 24（7）： 893-895

5 Nendza M， Herbst T， Kussatz C，Gies A.Chemosphere， 1997， 35（9）： 1875-1878

6 Mansy S， Tobias R S.Inor. Chem.， 1975， 14（2）： 287-291

7 MA Li Na，LIU Dian Jun，WANG Zhen Xin.Chinese J. Anal. Chem.， 2010， 38（1）： 1-7

馬立娜， 劉殿駿， 王振新. 分析化學， 2010， 38（1）： 1-7

8 Wang Y， Yang F， Yang X R.Biosens. and Bioelectro.， 2010， 25（8）： 1994-1998

9 Li D， Wieckowska A， Willner I.Angew. Chem. Int. Edit.， 2008， 47（21）： 3927-3931

10 Xiong C， Ling L S.Talanta ， 2012， 89： 317-321

11 Miao X M， Ling L S， Shuai X T.Anal. Biochem.， 2012， 421（2）： 582-586

12 Liu X， Dai Q， Austin L， Coutts J， Knowle G， Zou J H， Chen H， Huo Q.J. Am. Chem. Soc.，2008， 130（9）： 2780-2782

13 Jiang Z L， Fan Y Y， Chen M L， Liang A H， Liao X J， Wen G Q， Shen X C， He X C， Pan H C， Jiang H S.Anal. Chem.，2009， 81（13）： 5439-5445

14 Turkevich J， Stevenson P C， Hillier J.Discuss. Faraday Soc.，1951， 11： 55-75

15 Frens G.Nature Phys. Sci.， 1973， 241（105）： 20-22

16 Sikkema F D， Comellas Aragonès M， Fokkink R G， Verduin B J M， Cornelissen J J L M， Nolte R J M.Org. Biomol. Chem.，2007， 5（1）： 54-57

17 Rothberg L J， Li H X.J. Am. Chem. Soc.，2004， 126（35）： 10958-10961

18 Wang L H， Liu X F， Hu X F.Chem. Commun.，2006， （36）： 3780-3782

19 Li X K， Wang J E， Sun L L， Wang Z X.Chem. Commun.，2010， 46（6）： 988-990

20 WHO Guidelines for Drinking water Quality.World Health Organization， 4th edn， 2011

21 EPA， U.S.， Drinking Water Contaminants， http：//water.epa.gov/drink/contaminants/index.cfm#List， Accessed on 31 12 11

2 Harris H H， Pickering I J， George G N.Science， 2003， 301（5637）： 1203-1203

3 XU Jin Yong， WANG Tong， CHEN Du Jun， YE Long Hui， NI Shi Jun.Chinese J. Anal. Chem.， 2012， 40（1）： 169-172

徐進勇， 王 彤， 陳杜軍， 葉隆慧， 倪師軍. 分析化學， 2012， 40（1）： 169-172

4 SHI Jie， ZHU Yong Qin， GONG Xue Yun.Spectroscopy and Spectral Analysis， 2004， 24（7）： 893-895

石 杰， 朱永琴， 龔雪云. 光譜學與光譜分析， 2004， 24（7）： 893-895

5 Nendza M， Herbst T， Kussatz C，Gies A.Chemosphere， 1997， 35（9）： 1875-1878

6 Mansy S， Tobias R S.Inor. Chem.， 1975， 14（2）： 287-291

7 MA Li Na，LIU Dian Jun，WANG Zhen Xin.Chinese J. Anal. Chem.， 2010， 38（1）： 1-7

馬立娜， 劉殿駿， 王振新. 分析化學， 2010， 38（1）： 1-7

8 Wang Y， Yang F， Yang X R.Biosens. and Bioelectro.， 2010， 25（8）： 1994-1998

9 Li D， Wieckowska A， Willner I.Angew. Chem. Int. Edit.， 2008， 47（21）： 3927-3931

10 Xiong C， Ling L S.Talanta ， 2012， 89： 317-321

11 Miao X M， Ling L S， Shuai X T.Anal. Biochem.， 2012， 421（2）： 582-586

12 Liu X， Dai Q， Austin L， Coutts J， Knowle G， Zou J H， Chen H， Huo Q.J. Am. Chem. Soc.，2008， 130（9）： 2780-2782

13 Jiang Z L， Fan Y Y， Chen M L， Liang A H， Liao X J， Wen G Q， Shen X C， He X C， Pan H C， Jiang H S.Anal. Chem.，2009， 81（13）： 5439-5445

14 Turkevich J， Stevenson P C， Hillier J.Discuss. Faraday Soc.，1951， 11： 55-75

15 Frens G.Nature Phys. Sci.， 1973， 241（105）： 20-22

16 Sikkema F D， Comellas Aragonès M， Fokkink R G， Verduin B J M， Cornelissen J J L M， Nolte R J M.Org. Biomol. Chem.，2007， 5（1）： 54-57

17 Rothberg L J， Li H X.J. Am. Chem. Soc.，2004， 126（35）： 10958-10961

18 Wang L H， Liu X F， Hu X F.Chem. Commun.，2006， （36）： 3780-3782

19 Li X K， Wang J E， Sun L L， Wang Z X.Chem. Commun.，2010， 46（6）： 988-990

20 WHO Guidelines for Drinking water Quality.World Health Organization， 4th edn， 2011

21 EPA， U.S.， Drinking Water Contaminants， http：//water.epa.gov/drink/contaminants/index.cfm#List， Accessed on 31 12 11