基于磷酸化組蛋白H2AX的酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法評(píng)價(jià)卷煙煙氣基因毒性

付立偉+陳歡+楊進(jìn)+侯宏衛(wèi)+胡清源

摘 要 基于酶聯(lián)免疫原理，建立了定量測(cè)定細(xì)胞中磷酸化組蛋白H2AX（γH2AX）含量的新方法，并用于評(píng)價(jià)卷煙煙氣的基因毒性。采用不同劑量的煙氣氣相物與煙氣粒相物暴露于中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（CHO細(xì)胞），通過測(cè)定不同染毒時(shí)間下細(xì)胞中γH2AX含量水平變化，考察煙氣染毒與細(xì)胞DNA損傷的劑量效應(yīng)關(guān)系， 以及不同煙氣組分基因毒性的差異。此外，通過定量監(jiān)測(cè)細(xì)胞中活性氧的變化，探討卷煙煙氣暴露誘發(fā)細(xì)胞DNA雙鏈斷裂損傷的作用機(jī)理。結(jié)果表明， 隨煙氣暴露時(shí)間的增加，細(xì)胞中γH2AX的含量在幾小時(shí)內(nèi)達(dá)到峰值，然后逐漸下降；染毒濃度越高，細(xì)胞中γH2AX含量達(dá)到峰值的時(shí)間越長(zhǎng)；隨著煙氣粒相物或氣相物染毒濃度的增高，細(xì)胞中γH2AX含量水平呈上升趨勢(shì)；煙氣粒相物染毒相比煙氣氣相物對(duì)細(xì)胞中γH2AX含量的影響更為顯著；此外，煙氣成分直接染毒會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)活性氧的含量增加。細(xì)胞內(nèi)活性氧的含量變化與細(xì)胞DNA雙鏈斷裂標(biāo)志物γH2AX的含量變化有較強(qiáng)相關(guān)性，卷煙煙氣中自由基成分可能是誘發(fā)細(xì)胞DNA雙鏈斷裂的原因之一。

關(guān)鍵詞 磷酸化組蛋白H2AX；酶聯(lián)免疫方法；基因毒性

1 引 言

H2AX是組蛋白2A家族成員之一，在 DNA雙鏈斷裂（DNA double stranded breaks，DSBs）修復(fù)中起主要的信號(hào)傳輸作用。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生DSBs后，H2AX的絲氨酸殘基可以被毛細(xì)血管共濟(jì)失調(diào)突變基因（Ataxia telangiectasia mutated，ATM）和DNA依賴性蛋白激酶（DNA dependent protein kinase，DNA PK）等磷酸化，形成磷酸化組蛋白H2AX（γH2AX）[1～3]。γH2AX迅速在DSBs位點(diǎn)簇集，且γH2AX的形成與雙鏈斷裂的數(shù)量成正比[4]，從而使γH2AX成為DNA損傷/雙鏈斷裂的重要的特異性生物標(biāo)志物。煙氣中某些組分（如自由基）能直接作用于細(xì)胞中DNA[5]，或通過活化多環(huán)芳烴（例如苯并芘）生成多環(huán)芳烴DNA加合物[6]，最終導(dǎo)致各種形式的DNA損傷。其中，DNA雙鏈的斷裂被認(rèn)為是最嚴(yán)重的DNA損傷，DSBs修復(fù)失敗可觸發(fā)細(xì)胞凋亡，甚至破壞DNA信息，繼而導(dǎo)致突變、癌癥和遺傳損害。因此，基于γH2AX這一特異性生物標(biāo)志物檢測(cè)卷煙煙氣暴露引起的細(xì)胞DNA損傷，尤其是DSBs，將有助于評(píng)價(jià)卷煙煙氣的基因毒性。Albino等[7]通過熒光顯微鏡觀測(cè)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過煙氣冷凝物暴露后細(xì)胞內(nèi)γH2AX的熒光焦點(diǎn)數(shù)量增多，且與暴露劑量呈正相關(guān)；此外，Toyooka和Ibuki[8]檢測(cè)出細(xì)胞中γH2AX含量與煙氣暴露呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系。其采用的熒光顯微鏡方法可以獲得單個(gè)細(xì)胞中γH2AX的焦點(diǎn)數(shù)量，但使用人工計(jì)數(shù)，通量低，且無(wú)法避免檢測(cè)過程的主觀性。酶聯(lián)免疫方法（ELISA）具有操作簡(jiǎn)單快速，通量高，靈敏度高的優(yōu)勢(shì)[9]。本研究基于ELISA原理，建立了一種定量測(cè)定細(xì)胞中γH2AX含量的新方法，并用于考察不同的煙氣組分染毒、染毒時(shí)間、不同染毒劑量條件下，細(xì)胞中γH2AX含量水平變化。同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞中的活性氧（Reactive oxygen species，ROS），分析DNA損傷與活性氧的關(guān)系，探討煙氣自由基成分對(duì)細(xì)胞DNA雙鏈斷裂的影響。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

CO2培養(yǎng)箱（Thermo SERIES II WATER JACKET）；倒置顯微鏡IX7（Olympus IX73）；酶標(biāo)儀（MD Spectra Max M5）；自動(dòng)轉(zhuǎn)盤式吸煙機(jī)（Bolgwaldt RM200A）。

小鼠抗γH2AX單克隆抗體，兔抗總H2AX（不區(qū)分磷酸化）多克隆抗體（美國(guó)Biolegend公司）；過氧化辣根酶（Horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記山羊抗鼠抗體，堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，AP）標(biāo)記驢抗兔抗體（中杉金橋公司）；磷酸4 甲基散酮（Phosphoric acid 4 methyl ketone，4 MUP，欣百諾生物公司），10 乙?；?3，7 二羥基吩嗪（10 Acetyl 3， 7 dihydroxy phenazine，ADHP，欣百諾生物公司）；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基，胎牛血清（美國(guó)Gibco公司）；磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.2）、胰蛋白酶、聚乙二醇單辛基苯基醚（Triton X 100）、4%多聚甲醛（Solarbio公司）；二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO，美國(guó)Amresco公司）；活性氧檢測(cè)試劑盒（碧云天公司）；中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（Chinese hamster ovary cell，CHO）。

細(xì)胞膜通透液：0.5% Triton X 100的PBS緩沖液；封閉劑：2%牛血清白蛋白（Bovine serum adbumin， BSA）溶液；混合一抗溶液：使用前取適量兔抗H2AX抗體和小鼠抗γH2AX抗體混合，用2% BSA溶液稀釋至所需濃度；混合二抗溶液：使用前取適量HRP標(biāo)記驢抗鼠抗體和AP標(biāo)記羊抗兔抗體混合，用2% BSA溶液稀釋至所需濃度；HRP酶底物：用PBS緩沖溶液配制0.2 mmol/LADHP溶液，使用前與等體積的30% H2O2混勻；AP酶底物溶液：用PBS緩沖溶液配制0.3 mmol/L 4 MUP溶液。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 卷煙煙氣染毒樣本的制備 實(shí)驗(yàn)流程如圖1所示。卷煙樣品3R4F參比卷煙于溫度（22±1）℃和相對(duì)濕度60%±3%條件下平衡48 h。使用轉(zhuǎn)盤式吸煙機(jī)在ISO抽吸條件下抽吸卷煙，煙氣總粒相物（Cigarette smoke total particulate matter，TPM）用劍橋?yàn)V片收集，根據(jù)TPM質(zhì)量加入相應(yīng)體積的二甲亞砜， 得到最終濃度為10 g/L的TPM標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。使用前在

Symbolm@@ 80 ℃儲(chǔ)存。在收集煙氣總粒相物的同時(shí)將氣相物通入裝有PBS的吸收瓶（冰浴）中，粒相物收集完畢后，將PBS吸收液定容至與粒相物儲(chǔ)備液中DMSO相同的體積，通過0.2 μm 濾膜除菌后，得到最終濃度為10 g/L TPM的煙氣氣相物（Cigarette smoke condensate，CSC）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，且必須在制備后30 min內(nèi)使用。

2.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及處理 CHO細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基中，于37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)。細(xì)胞匯合率70%～80%時(shí)，將細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消解，培養(yǎng)基重懸制成單細(xì)胞懸液后，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至1×105個(gè)/mL，按每孔100 μL接種到96孔板，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。傳代細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，棄去培養(yǎng)基，加入100 μL不同濃度梯度的煙氣粒相物萃取液或煙氣氣相物吸收液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染毒，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照組。

2.2.3 細(xì)胞中γH2AX的測(cè)定 （1）細(xì)胞固定 染毒后的細(xì)胞用PBS洗滌兩次，每次5 min，除去染毒溶液。每孔加入100 μL 4%多聚甲醛，室溫固定15 min；（2）細(xì)胞通透 固定好的CHO細(xì)胞用PBS洗滌3次，每孔加入100 μL通透液室溫孵育15 min；（3）細(xì)胞封閉 PBS洗滌3次，加入封閉液37 ℃孵育1 h； 每孔加入100 μL含有兔抗H2AX抗體和小鼠抗γH2AX抗體組成的一抗混合液，4 ℃過夜；（4）恒溫孵育 PBS充分洗滌3次，加混合二抗溶液，在37 ℃恒溫培育2 h；（5）熒光檢測(cè) PBS洗滌3次，向微孔板中加入75 μL的辣根酶底物，孵育30 min，再加入75 μL堿性磷酸酶底物，孵育30 min后經(jīng)熒光酶標(biāo)儀（540 nm處激發(fā)， 600 nm處檢測(cè)； 360 nm處激發(fā)，450 nm處檢測(cè)）測(cè)定熒光強(qiáng)度值。本實(shí)驗(yàn)在檢測(cè)目標(biāo)物γH2AX的同時(shí)，對(duì)細(xì)胞中總H2AX（不區(qū)分磷酸化標(biāo)記）也進(jìn)行了定量測(cè)定。根據(jù)目標(biāo)物γH2AX與總H2AX熒光檢測(cè)信號(hào)的比值確定H2AX的磷酸化程度。

2.2.4 細(xì)胞中活性氧的檢測(cè) 將1×105個(gè)/mL細(xì)胞以100 μL接種在96孔板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。傳代細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，棄去培養(yǎng)基，每孔加入100 μL 10 μmol/L雙氫乙酰乙酸 二氯熒光黃（Dihydrochloride acetyl acid dichloride fluorescent yellow，DCFH DA），37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育20 min。孵育完成后用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，充分除去未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH DA。每孔加入100 μL不同濃度梯度的煙氣粒相物萃取液，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照（只加正常培養(yǎng)基）和陽(yáng)性對(duì)照組。染毒2 h后用酶標(biāo)儀檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)525 nm。

3 結(jié)果與討論

3.1 酶聯(lián)免疫法檢測(cè)磷酸化蛋白H2AX的原理

本研究建立了細(xì)胞DNA損傷標(biāo)志物磷酸化組蛋白H2AX（γH2AX）的酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法，原理如圖2所示。即采用一種特異性γH2AX抗體及酶標(biāo)二抗對(duì)目標(biāo)蛋白γH2AX特異性?shī)A心識(shí)別。加入酶反應(yīng)底物后，底物被酶催化為有色產(chǎn)物，可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺實(shí)現(xiàn)對(duì)γH2AX定量測(cè)定的方法。檢測(cè)γH2AX的同時(shí)，加入特異性H2AX抗體及相應(yīng)酶標(biāo)二抗對(duì)總H2AX特異性識(shí)別。檢測(cè)的總H2AX蛋白包含磷酸化和非磷酸化H2AX蛋白，目的是消除由細(xì)胞個(gè)數(shù)差異引起的信號(hào)偏差。計(jì)算出γH2AX熒光強(qiáng)度比值（γH2AX熒光強(qiáng)度比值=γH2AX熒光值/（H2AX熒光值-空白值注）， 空白值為不加一抗只加二抗條件下γH2AX與H2AX的熒光比值），減小平行樣本熒光檢測(cè)信號(hào)的偏差，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物γH2AX的準(zhǔn)確定量。

3.2 抗體濃度的優(yōu)化

酶聯(lián)免疫法對(duì)細(xì)胞中γH2AX測(cè)定的靈敏度取決于特異性識(shí)別的一抗與目標(biāo)物分子的結(jié)合量，其間接影響酶標(biāo)記的二抗分子對(duì)目標(biāo)分子的特異性識(shí)別。為提高檢測(cè)靈敏度，分別對(duì)實(shí)驗(yàn)中小鼠抗γH2AX抗體及其對(duì)應(yīng)的二抗?jié)舛冗M(jìn)行了優(yōu)化。由圖3A可知， 當(dāng)小鼠抗γH2AX抗體稀釋濃度范圍在0.6～1.0 mg/L時(shí)，發(fā)射波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定的熒光強(qiáng)度最大。因此本實(shí)驗(yàn)中選擇小鼠抗γH2AX抗體的最佳濃度為0.8 mg/L。圖3B所示為使用相同濃度的小鼠抗γH2AX抗體和不同濃度的HRP酶標(biāo)記的驢抗鼠抗體對(duì)相同目標(biāo)物分析時(shí)，在熒光酶標(biāo)儀上測(cè)定的熒光強(qiáng)度值。由圖3B可知，當(dāng)HRP酶標(biāo)記的驢抗鼠抗體稀釋濃度為4～6 mg/L時(shí)，發(fā)射波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定的熒光強(qiáng)度最大。因此選用的HRP酶標(biāo)記的驢抗鼠抗體稀釋濃度為5 mg/L。

3.3 不同暴露時(shí)間對(duì)細(xì)胞中γH2AX含量的影響

為研究不同暴露時(shí)間對(duì)細(xì)胞內(nèi)γH2AX含量的影響，采用煙氣粒相物分別暴露于CHO細(xì)胞。暴露劑量為25，50，100和150 mg/L，每個(gè)劑量暴露時(shí)間設(shè)為0，0.5，1，2，4，8，12和24 h。從圖4可見，染毒濃度為25和50 mg/L 的細(xì)胞，約暴露2 h，γH2AX含量達(dá)到峰值，染毒濃度為100和150 mg/L的細(xì)胞分別在4和8 h左右細(xì)胞中γH2AX含量達(dá)到峰值。γH2AX含量達(dá)到最大值后隨時(shí)間增加整體呈下降趨勢(shì)?？傮w上，24 h后高劑量粒相物暴露的細(xì)胞內(nèi)γH2AX的含量仍然高于低劑量暴露水平的細(xì)胞。有研究發(fā)現(xiàn)， 煙霧提取物暴露細(xì)胞可引起細(xì)胞DNA雙鏈斷裂，γH2AX峰值出現(xiàn)在暴露4 h左右，然后逐漸降低[10]。細(xì)胞自身存在DNA損傷修復(fù)功能，隨著DNA雙鏈斷裂的重新連接修復(fù)，γH2AX會(huì)發(fā)生去磷酸化。γH2AX可能通過組蛋白交換的方式，從染色體上解離[11]，或者在去磷酸化酶的作用下恢復(fù)為H2AX[12]。細(xì)胞中存在DNA損傷修復(fù)機(jī)制，但修復(fù)程度與煙氣粒相物暴露濃度有關(guān)，不同濃度粒相物暴露可能觸發(fā)的修復(fù)機(jī)制不同。

3.4 不同濃度煙氣染毒對(duì)細(xì)胞中γH2AX含量的影響

為考察煙氣不同組分和濃度暴露對(duì)細(xì)胞中γH2AX含量的影響，實(shí)驗(yàn)采用煙氣氣相物及粒相物分別暴露于CHO細(xì)胞。暴露濃度梯度為10，25，50，75，100，150和200 mg/L，暴露時(shí)間根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)設(shè)為4 h。同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組（未染毒和不加一抗抗體）。由圖5可知，

結(jié)果表明，煙氣暴露尤其是煙氣粒相物暴露能引起CHO細(xì)胞內(nèi)H2AX的磷酸化，且磷酸化程度與暴露劑量呈正相關(guān)。有研究證實(shí)，γH2AX的形成與DNA雙鏈斷裂數(shù)量存在一一對(duì)應(yīng)關(guān)系[4]，是DNA損傷的重要生物標(biāo)志物。因此，煙氣暴露能造成細(xì)胞的DNA雙鍵斷裂，且存在劑量效應(yīng)關(guān)系。同時(shí)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)煙氣粒相物暴露對(duì)細(xì)胞中γH2AX含量的影響明顯大于煙氣氣相物。煙氣氣相物中具有直接基因毒性的物質(zhì)，需要進(jìn)一步體外活化才能造成DSBs，而具有間接基因毒性的物質(zhì)只能對(duì)細(xì)胞分裂期造成干擾形成DSBs[13]。因此直接將煙氣氣相物暴露于CHO細(xì)胞可能對(duì)細(xì)胞中γH2AX含量的影響較小。但煙氣粒相物和氣相物都是復(fù)雜的混合物，有超過150種有毒物質(zhì)[14]。目前仍無(wú)法確定煙氣中對(duì)形成γH2AX起關(guān)鍵作用的毒性物質(zhì)。

3.5 活性氧檢測(cè)

每支卷煙所產(chǎn)生的煙霧中約含有1015個(gè)自由基。其中氣相中包括烷氧基（RO·）、烷過氧基（ROO·）及烷基（R·）等不穩(wěn)定自由基，焦油相中則含有高濃度的穩(wěn)定自由基（如半醌自由基和芳香烴自由基等）[5]。卷煙煙氣中的自由基，可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生活性氧直接攻擊DNA造成DSBs，或與DNA上的堿基形成加合物，使堿基脫失形成無(wú)嘌呤嘧啶（Apurinic/apyrimidinic，AP）位點(diǎn)，從而發(fā)生DSBs[15]。為探討煙氣染毒誘發(fā)細(xì)胞DNA雙鏈斷裂的作用機(jī)理，本實(shí)驗(yàn)采用煙氣粒相物和氣相物分別暴露于CHO細(xì)胞。染毒劑量為0， 10， 25， 50， 75， 100和150 mg/L，暴露時(shí)間為0.5， 1， 2， 3和4 h。利用熒光探針雙氫乙酰乙酸 二氯熒光黃（Dihydrochloride acetyl acid dichloride fluorescent yellow，DCFH DA）檢測(cè)活性氧，

這種熒光探針可以自由進(jìn)入細(xì)胞，被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成2，7 二氫二氯熒光素（2，7 Dihydro dichloride fluorescein，DCFH），而DCFH不能通透細(xì)胞膜，細(xì)胞內(nèi)的活性氧可以將其氧化生成有熒光物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果如圖6所示，煙氣粒相物暴露的細(xì)胞中活性氧含量均有所上升，且隨暴露濃度增加，活性氧含量逐漸升高。而氣相物暴露后的細(xì)胞內(nèi)活性氧含量隨暴露濃度增加也呈上升趨勢(shì)，但變化并不明顯。對(duì)比圖5和圖6可見，相同暴露條件下CHO細(xì)胞中ROS的變化趨勢(shì)與γH2AX的變化趨勢(shì)相一致。研究表明，煙氣粒相物可誘導(dǎo)CHO細(xì)胞產(chǎn)生ROS，且隨著煙氣粒相物劑量的加大，[TS（4][HT5”SS] 圖6 細(xì)胞中活性氧檢測(cè)熒光強(qiáng)度與染毒濃度的劑量效應(yīng)曲線

Fig.6 Dose effect curve of exposure concentrations of CSC and TPM and reactive oxygen species（ROS） in cellsROS的濃度也逐漸升高。煙氣粒相物暴露后細(xì)胞內(nèi)ROS和γH2AX含量的變化具有很好的相關(guān)性。煙氣粒相物中半醌自由基可與DNA堿基特別是鳥嘌呤形成DNA加合物[6]；煙氣粒相物中芳香烴自由基參與多環(huán)芳烴的氧化，生成的親電衍生物可攻擊DNA，或生成DNA加合物[16]。DNA氧化損傷和DNA加合物是卷煙煙氣導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生DSBs的主要作用機(jī)制[17]。因此，煙氣粒相物中穩(wěn)定的自由基可能是DBS的形成原因之一。

4 結(jié) 論

基于ELISA原理，建立了一種定量測(cè)定細(xì)胞中γH2AX的方法，并應(yīng)用于煙氣不同組分基因毒性的評(píng)價(jià)。通過同時(shí)測(cè)定細(xì)胞中H2AX含量，有效地消除細(xì)胞個(gè)數(shù)差異造成的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，煙氣粒相物和氣相物暴露CHO細(xì)胞，均會(huì)造成細(xì)胞中γH2AX含量的升高，且存在時(shí)間劑量效應(yīng)關(guān)系，但粒相物相比氣相物對(duì)CHO細(xì)胞γH2AX含量的影響更為顯著。煙氣成分暴露可導(dǎo)致細(xì)胞中ROS含量升高。細(xì)胞中ROS的變化趨勢(shì)與γH2AX的變化趨勢(shì)相一致，煙氣粒相物中穩(wěn)定的自由基可能是DBS的形成原因之一。

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10 FU Qiang，CHENG Jing，HAN Zhong Bo，LI Xiao Lan.Chin. J. Cancer，2006， 25（10）： 1191-1197

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11 Benson L J， Gu Y， Yakovleva T， Warner C， Okayasu R， Bedford J S.J. Biol. Chem.， 2006， 281（14）： 9287-9296

12 Gavrilov B， Vezhenkova I， Firsanov D， Solovjeva L， Svetlova M， Mikhailov V， Tomilin N.Biochem. Biophys. Res. Commun.， 2006， 347（4）： 1048-1052

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14 Cunningham F， Fiebelkorn S， Johnson M， Meredith C A.Food. Chem. Toxicol.， 2011， 49（11）： 2921-2933

15 Liu X， Conner H， Kobayashi T， Kim H， Wen F， Abe S， Fang Q， Wang X， Hashimoto M， Bitterman P.Am. J. Respir. Cell Mol. Biol.， 2005， 33（2）： 121-129

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