GM-CSF 與生長抑素共表達(dá)基因疫苗的構(gòu)建和鑒定

魏金鋼，韓曉萍，劉英俊，蘭芳菲，梁愛心，吳紅翔，舒鄧群*

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西 南昌 330045;2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

生長速度、產(chǎn)肉率和飼料利用率等是衡量肉用動物生產(chǎn)性能的主要指標(biāo)，動物的生長既可以從營養(yǎng)方面調(diào)控，也可以通過動物生長軸的調(diào)控進(jìn)行調(diào)節(jié)。動物生長軸是由動物體內(nèi)下丘腦-垂體-靶器官及其相關(guān)的激素和受體所組成的具有自動調(diào)節(jié)的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)，下丘腦分泌生長激素釋放因子(growth hormone-releasing factor，GRF)和生長抑素(somatostatin，SS)，GRF 促進(jìn)垂體加強生長激素(growth hormone，GH)的分泌，從而促進(jìn)動物的生長;生長抑素則抑制垂體分泌生長激素，從而抑制動物的生長。粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)是一個具有多項潛能的造血生長因子，不僅能刺激造血祖細(xì)胞增殖、分化和成熟，而且還能活化中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、DC 及其它單核細(xì)胞，常用作DNA 疫苗的免疫佐劑，以提高DNA 疫苗的免疫效果［1］。舒鄧群等以豬的真核表達(dá)質(zhì)粒pGM-CSF 為模板，構(gòu)建GM-CSF 與SS 融合表達(dá)質(zhì)粒(pGM-CSF/SS)，免疫小鼠后，可增強小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的增殖能力，提高生長抑素抗體的P/N 值［2］，提高肌肉組織中GHR 和IGF-I mRNA 的表達(dá)［3］。本研究利用動物的生長軸的原理，采用生物工程的方法，應(yīng)用共表達(dá)載體pIRES 將GM-CSF 基因和SS 基因分別克隆到載體的多克隆位點A 和B，構(gòu)建共表達(dá)基因疫苗，旨在同時表達(dá)GM-CSF 和SS 兩種蛋白，研究基因佐劑GM-CSF 對生長抑素的免疫增強作用，為提高動物的生產(chǎn)性能提供理論基礎(chǔ)。

圖1 pIRES 質(zhì)粒結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of pIRES plasmid

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒和菌種

質(zhì)粒pIRES 由暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院血液病研究所李揚秋老師惠贈，質(zhì)粒結(jié)構(gòu)見圖1。質(zhì)粒pVGS/2SS-asd 由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)楊利國教授惠贈［4］，該質(zhì)粒包括GM-CSF 片段和含有乙肝表面抗原的2SS 片段，E.coli DH5α受體菌購于天根生物有限公司。

圖2 pIRES-GM-CSF/2SS 質(zhì)粒的構(gòu)建圖Fig.2 Schematic illustration for construction of pIRES-GM-CSF/2SS

1.2 酶和試劑

Taq DNA 聚合酶;DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)DL5000 和DL10000;pEASYTM-T1 Simple T載體;T4DNA 連接酶均購自北京全式金有限公司;PCR 產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒由北京原平皓公司生產(chǎn);限制性內(nèi)切酶Xba Ⅰ、Nhe I、EcoR Ⅰ、Not I、Sal I 購 于Toyobo 公司;其它試劑均為國產(chǎn)分析純。GM-CSF 與SS 共表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建的技術(shù)路線見圖2。

1.3 引物的設(shè)計與合成

采用Primer 5.0 軟件設(shè)計引物，分別根據(jù)豬的GM-CSF 序列［5］和2SS 片段(含有乙肝表面抗原S 基因)序列設(shè)計擴增GM-CSF 和2SS 片段的引物［6］(表1)，設(shè)計引物由上海生物工程有限公司合成。

表1 目的基因引物參數(shù)Tab.1 Parameter of oligo-nucleotide primer pairs for the target genes

1.4 pIRES 質(zhì)粒的提取與酶切

將pIRES 質(zhì)粒轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌E.coli DH5α中，鋪板與擴大培養(yǎng)后挑取單菌落進(jìn)行培養(yǎng)，采用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒pIRES，然后進(jìn)行酶切，酶切體系為:10×M buffer 1.0 μL、XbaⅠ0.2 μL、EcoR I 0.2 μL、pIRES 質(zhì)粒2 μL、ddH2O 至總體積10 μL，37 ℃，反應(yīng)2～3 h，酶切后，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果。

1.5 pIRES-GM-CSF 質(zhì)粒的構(gòu)建

1.5.1 GM-CSF 基因的擴增 按試劑盒說明書抽提和純化pVGS/2SS-asd 質(zhì)粒。以pVGS/2SS-asd質(zhì)粒為模板，按照如下PCR 反應(yīng)體系進(jìn)行GM-CSF 基因的擴增:5×Buffer 2 μL、d NTP 0.4 μL、Taq DNA 聚合酶0.4 μL、引物p1、p2 各0.5 μL、pVGS/2SS-asd 質(zhì)粒1.5 μL、ddH2O 至合計20 μL。按以下條件進(jìn)行PCR 反應(yīng):94 ℃變性6 min，然后，94 ℃變性1 min、51 ℃退火1 min、72 ℃延伸1 min，35 個循環(huán)后72 ℃續(xù)延10 min、16 ℃降溫5 min。PCR 產(chǎn)物1.0%瓊脂糖電泳檢測，膠回收，純化和定量，備用。

1.5.2 GM-CSF 基因與T 載體相連 按照如下連接體系將GM-CSF 基因與T 載體進(jìn)行相連:PCR 的產(chǎn)物GM-CSF 4 μL、T-載體1 μL，35 ℃反應(yīng)15 min，將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α中，培養(yǎng)后，采用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒TGM-CSF 質(zhì)粒。然后按以下酶切體系進(jìn)行酶切鑒定:T-GMCSF 質(zhì)粒2 μL、Nhe I 0.1 μL、EcoR I 0.3 μL、10×M Buffer 1 μL、加ddH2O 至總體積10 μL，鑒定正確的質(zhì)粒送往北京奧科生物技術(shù)有限公司測序，備用。

1.5.3 pIRES-GM-CSF 質(zhì)粒的構(gòu)建 純化后的pIRES 質(zhì)粒和TGM-CSF 質(zhì)粒分別用Nhe I 和EcoR I 雙酶切，酶切體系分別為:pIRES 質(zhì)粒12 μL、Nhe I 0.4 μL、EcoR I 0.8 μL、10×M Buffer2 μL、加dd H2O 至總體積20 μL;TGM-CSF 12 μL、Nhe I 0.2 μL、EcoR I 0.2 μL、10×M Buffer 2 μL、加ddH2O 至總體積20 μL，37 ℃，反應(yīng)2～3 h，酶切后，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳，分別分離回收pIRES 大片段和GM-CSF 片段，備用。

然后，將回收、純化的pIRES 大片段和GM-CSF 片段按如下體系進(jìn)行連接反應(yīng):pIRES 載體線性片段1 μL、GM-CSF 線性片段4 μL、5×T4Ligase Buffer 2 μL、T4DNA Ligase 1 μL、dd H2O 2 μL、共計10 μL，23 ℃水浴，連接20 min。

1.5.4 陽性重組質(zhì)粒(pIRES-GM-CSF)的篩選和鑒定 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli DH5α細(xì)菌，固體培養(yǎng)基鋪板培養(yǎng)，挑取陽性克隆，LB 培養(yǎng)，提取質(zhì)粒DNA，進(jìn)行酶切鑒定，酶切體系為:陽性克隆2 μL、Nhe I 0.1 μL、EcoR I 0.3 μL、10×M Buffer 1 μL、ddH2O 至總體積10 μL，37 ℃，反應(yīng)2～3 h，1.0%瓊脂糖電泳檢測，電泳條帶與目的條帶大小相符，鑒定正確的質(zhì)粒送往北京奧科生物技術(shù)有限公司測序，獲得的陽性克隆命名為pIRES-GM-CSF。

1.6 pIRES-GM-CSF/2SS 質(zhì)粒的構(gòu)建

1.6.1 2SS 基因的擴增 以pVGS/2SS-asd 質(zhì)粒為模板，按照如下PCR 反應(yīng)體系進(jìn)行SS 基因的擴增:5×Buffer 2 μL、d NTP 0.4 μL、Taq DNA 聚合酶0.4 μL、引物p3、p4 各0.5 μL、pVGS/2SS-asd 模板1.5 μL、ddH2O 至總體積20 μL，按以下條件進(jìn)行PCR 反應(yīng):94 ℃變性6 min，然后94 ℃變性1 min、54.9 ℃退火1 min、72 ℃延伸1 min，35 個循環(huán)后，72 ℃續(xù)延10 min、16 ℃降溫5 min，PCR 產(chǎn)物1.0%瓊脂糖電泳檢測，膠回收，純化和定量，備用。

1.6.2 T2SS 質(zhì)粒的構(gòu)建 將2SS 的PCR 產(chǎn)物與T 載體相連，連接體系:PCR 的產(chǎn)物2SS 4 μL、T 載體1 μL、35 ℃反應(yīng)15 min，反應(yīng)結(jié)束后放于冰上。然后將陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)入DH5α，進(jìn)行培養(yǎng)擴增，提取T2SS質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，酶切體系為T2SS 2 μL、Not I 0.2 μL、Sal I 0.2 μL、10×H Buffer 1 μL、dd H2O 至總體積共計10 μL，酶切產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖電泳檢測，同時，將鑒定正確的質(zhì)粒送往北京奧科生物技術(shù)有限公司測序，測序正確的質(zhì)粒進(jìn)行保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.3 pIRES-GM-CSF/2SS 質(zhì)粒的構(gòu)建 純化后的pIRES-GM-CSF 質(zhì)粒和T2SS 質(zhì)粒分別采用NotI 和SalI 雙酶切pIRES-GM-CSF 質(zhì)粒酶切體系為:pIRES-GM-CSF 質(zhì)粒12 μL、Not I 1 μL、Sal I 1 μL、10×H Buffer 2 μL、dd H2O 至總體積20 μL;T2SS 質(zhì)粒酶切體系為:T2SS 11.2 μL、Not I 0.8 μL、Sal I 1 μL、10×H Buffer 2 μL、dd H2O 至總體積20 μL。分別在37℃，反應(yīng)2～3 h，回收、純化的pIRES-GM-CSF 大片段和2SS 片段，1.0%瓊脂糖電泳檢測，酶切產(chǎn)物保存?zhèn)溆谩?/p>

將回收、純化的pIRES-GM-CSF 大片段和2SS 片段按如下體系進(jìn)行連接反應(yīng):pIRES-GM-CSF片段1 μL、2SS 線性片段5 μL、5×T4Ligase Buffer2 μL、T4DNA Ligase 1 μL、dd H2O 至總體積10 μL，23℃水浴，連接20 min。連接產(chǎn)物備用。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli DH5α細(xì)菌，固體培養(yǎng)基鋪板培養(yǎng)，挑取陽性克隆，LB 培養(yǎng)，提取質(zhì)粒DNA。

1.6.4 pIRES-GM-CSF/2SS 的酶切鑒定和測序 將上述提取的質(zhì)粒按如下體系進(jìn)行酶切鑒定:酶切體系1:陽性克隆2 μL、Nhe I 0.1 μL、EcoR I 0.3 μL、10×M Buffer1 μL、dd H2O 至總體積10 μL;酶切體系2:陽性克隆2 μL、Not I 0.2 μL、Sal I 0.2 μL、10×H Buffer 1 μL、dd H2O 至總體積10 μL，37 ℃，反應(yīng)2～3 h，1.0%瓊脂糖電泳檢測，將鑒定正確的質(zhì)粒送往北京奧科生物技術(shù)有限公司測序，獲得的陽性克隆命名為pIRES-GM-CSF/2SS。

2 結(jié)果與分析

2.1 pIRES 質(zhì)粒提取

用試劑盒提取目的質(zhì)粒，用TE 溶解后，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖3 所示。由圖3 可見，在5 000 bp 之后有條6 100 bp 的條帶，與pIRES 質(zhì)粒大小相符，而且，OD260/OD280值均在1.8～2.0 之間，說明DNA 純度較高，可直接用于酶切反應(yīng)。再用Xba I 和EcoR I 酶切pIRES 質(zhì)粒，結(jié)果見圖4。由圖4 可以看出，在500～750 bp 之間有條651 bp 的條帶，與IRES 片段大小相符。

圖3 pIRES 質(zhì)粒Fig.3 pIRES plasmid

圖4 pIRES 質(zhì)粒的酶切Fig.4 Digestion of pIRES plasmid

2.2 GM-CSF 片段的擴增

采用pVGS/2SS-asd 模板，通過PCR 的方法擴增GM-CSF 的片段，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，結(jié)果如圖5 所示，由圖5 可見，在250～500 bp之間有條465 bp 條帶，與GM-CSF 片段的大小符合。

2.3 TGM-CSF 質(zhì)粒的提取

將T 載體與GM-CSF 片段連接，35 ℃、反應(yīng)15 min，然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)的大腸桿菌，提取質(zhì)粒鑒定，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖6 所示。由圖6可見，在3 000～5 000 bp 之間有條4 299 bp 的條帶，與TGM-CSF 質(zhì)粒的大小相符。

2.4 TGM-CSF 質(zhì)粒的雙酶切鑒定

用EcoR I 和Nhe I 對TGM-CSF 質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，37 ℃酶切3 h，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖7 所示。由圖7 可見，3 829 bp 的條帶為T 載體，與T 載體的大小相符;另外，在圖還可看到條465 bp 的條帶，與GM-CSF 片段的大小相符。

圖5 GM-CSF 的PCR 片段Fig.5 GM-CSF fragment by PCR

圖6 TGM-CSF 質(zhì)粒Fig.6 TGM-CSF plasmid

圖7 TGMCSF 質(zhì)粒酶切Fig.7 Digestion of TGM-CSF plasmid

2.5 pIRES-GM-CSF 質(zhì)粒的鑒定

將pIRES 質(zhì)粒和TGM-CSF 質(zhì)粒分別用EcoR I和Nhe I 雙酶切，37 ℃酶切3 h，然后回收pIRES 的大片段和GM-CSF 片段，回收的片段后在23 ℃水浴環(huán)境下連接20 min，然后導(dǎo)入大腸桿菌，提取質(zhì)粒用EcoR I 和Nhe I 雙酶切鑒定，37 ℃酶切3 h，酶切結(jié)果用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖8 所示。由圖8 可見，一條6 089 bp 的條帶與pIRES 載體的大小相符，還有一條465 bp 的條帶與GM-CSF 目的片段的大小相符。

2.6 PCR 擴增SS 目的基因

以pVGS/2SS-asd 質(zhì)粒為模板擴增SS 基因，擴增結(jié)果1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖9 所示。由圖9 可見，有一條822 bp 的條帶，與預(yù)期的2SS 片段的大小相符。

圖8 pIRES-GM-CSF 酶切Fig.8 Digestion of pIRES-GM-CSF plasmid

圖9 擴增的SS 片段Fig.9 PCR fragment of 2SS

2.7 T2SS 質(zhì)粒的鑒定

將SS 片段回收后與T 載體連接，35 ℃反應(yīng)15 min，回收后導(dǎo)入大腸桿菌，提取質(zhì)粒。用EcoR I和Nhe I 酶切質(zhì)粒，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖10 所示。由圖10 可見，有條822 bp 的條帶，與預(yù)期的2SS 片段大小相符。

2.8 pIRES-GM-CSF/2SS 的鑒定

分別用Not I 和Sal I、EcoR I 和Nhe I 酶切共表達(dá)基因疫苗pIRES-GM-CSF/2SS，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖11 所示。從電泳圖中可以看出有條465 bp 的條帶，與目的片段GM-CSF 的大小相符，另有條822 bp 的條帶，與目的片段2SS 的大小相符。

圖10 T2SS 酶切Fig.10 Digestion of T2SS

圖11 pIRES-GM-CSF/2SS 酶切Fig.11 Digestion of pIRES-GM-CSF/2SS plasmid

3 討論

曹少先等成功構(gòu)建了生長抑素基因疫苗pcS/SS，且在真核細(xì)胞中都得到很好的表達(dá)，具有SS 的反應(yīng)原性，用pcS/SS 免疫SD 大鼠，50 μg 的劑量表現(xiàn)出良好的免疫反應(yīng)性，抗體陽性率為60%［6］。但由于種與種之間的免疫遺傳差異，DNA 疫苗對大動物特別是對哺乳動物，免疫原性差［7］，免疫效果往往不理想，因而影響DNA 疫苗的實用性。要獲得效力更持久、免疫應(yīng)答更強以及最優(yōu)化的免疫應(yīng)答，需進(jìn)一步改善DNA 疫苗的免疫應(yīng)答。使用重組的細(xì)胞因子蛋白或質(zhì)粒編碼的細(xì)胞因子作為基因佐劑，即采用將抗原基因與細(xì)胞因子質(zhì)粒聯(lián)合注射、融合表達(dá)或共表達(dá)的方式，可增強機體免疫應(yīng)答效率，提高免疫效果。

GM-CSF 由多種細(xì)胞分泌，能夠刺激和活化專業(yè)的APC，可提高體液免疫和CTL 應(yīng)答，因而是基因免疫中極有應(yīng)用前景的細(xì)胞因子［8］。大量研究表明，編碼GM-CSF 的質(zhì)粒能增強DNA 疫苗的免疫效果［9］。

目前基因疫苗與基因佐劑表達(dá)的方式有以下3 種:(1)共注射:采用表達(dá)質(zhì)粒分別構(gòu)建基因疫苗和佐劑質(zhì)粒，然后在動物的不同部位分別注射這兩種質(zhì)粒。李琳等同時對小鼠注射pcDNA3/mGM-CSF和pcDNA3/MDC-VP1，發(fā)現(xiàn)GM-CSF 基因?qū)cDNA3/MDC-VP1 有免疫增強的作用，但是其存在操作相對來說比較繁瑣，可能存在局部免疫不均勻［10］。(2)共免疫:采用表達(dá)質(zhì)粒將目的基因與佐劑以融合表達(dá)的形式構(gòu)建融合表達(dá)基因疫苗。舒鄧群等首先成功構(gòu)建了融合表達(dá)基因疫苗pGM-CSF/SS，通過小鼠口服融合表達(dá)疫苗pGM-CSF/SS 的免疫方式，觀察其對小鼠淋巴細(xì)胞增殖和GH、IGF-Ⅰ分泌的影響，發(fā)現(xiàn)pGM-CSF/SS 的免疫效果優(yōu)于pGM-CSF+pcS/2SS 組［11］。(3)共表達(dá)基因疫苗:在一個共表達(dá)質(zhì)粒的兩個多克隆位點上同時克隆目的基因和佐劑基因，可同時表達(dá)2 個完全獨立的蛋白。李闖等構(gòu)建的TCR Vα1-pIRES-TCR Vβ8 的共表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染A549 和Molt4 細(xì)胞后，在mRNA 和蛋白水平檢測到了TCR Vα1 和TCR Vβ8 的表達(dá)，為利用特異性TCR 基因修飾T 細(xì)胞的研究提供方法學(xué)依據(jù)［12］。韓雷等構(gòu)建了pIRES-hVEGF121cDNA/hBMP-4 質(zhì)粒，并且在轉(zhuǎn)染COS-7 細(xì)胞，提取總RNA和總蛋白，進(jìn)行RT-PCR 和Western-blot 分別檢測到目的基因和目的蛋白［13］。

IRES 序列來源于腦心肌炎病毒(ECMV)，它具有不依賴于5'帽子結(jié)構(gòu)的翻譯起始，pIRES 載體質(zhì)粒上有兩個多克隆位點MCSA 和MCSB，當(dāng)目的基因被克隆進(jìn)這兩個位點時，該載體能夠同時翻譯出兩種目的蛋白。Camille Allera-Moreau 等用光度計檢測到連接了IRES 的FGF-1 和FGF-2 基因在小鼠肌肉細(xì)胞中的表達(dá)［14］。Liu S 等通過構(gòu)建pIRES-Sj97-Sj14-Sj26 免疫小鼠，通過ELISA 檢測抗體和MTT 法檢測CD4+and CD8+T 細(xì)胞增值，發(fā)現(xiàn)其與對照組相比能夠增強小鼠的免疫力［15］。胡剛等首先構(gòu)建了pIRES-PML-RARα-hIL-2 重組質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)染A549 細(xì)胞，通過點雜交試驗和ELISA 檢測到這兩個基因的表達(dá)［16］。黃梅娟等分別構(gòu)建了pIRES-Jurkat Vβ8、pIRES-Molt4 Vβ2(1)和pIRES-Molt4 Vβ2(2)三種質(zhì)粒，首先通過測序證明質(zhì)粒構(gòu)建的正確性，然后轉(zhuǎn)染K562 細(xì)胞，通過間接免疫熒光法、SDS-PAGE 和Western-blotting 等檢測其能夠表達(dá)相應(yīng)的目的蛋白［17］。

本研究利用共表達(dá)載體pIRES，分別在核糖體進(jìn)入位點(IRES)的兩個多克隆位點(MCSA 和MCSB)分別克隆GM-CSF 基因和SS 基因，成功構(gòu)建了含GM-CSF 基因和SS 基因的共表達(dá)基因疫苗pIRES-GM-CSF/2SS，為共表達(dá)基因疫苗pIRES-GM-CSF/2SS 的后續(xù)研究奠定了良好的基礎(chǔ)。

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