文心蘭一個PEBP 家族基因的克隆、表達及載體構(gòu)建

袁秀云，梁 芳，蔣素華，王默霏，劉 佳，崔 波*

(1.鄭州師范學院 生物工程研究所，河南 鄭州 450044;2.河南農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院，河南 鄭州 450002)

PEBP 家族基因廣泛存在于細菌［1］、酵母［2］、植物［3］和動物［4-5］中，其編碼的蛋白序列與磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白(phosphatidylethanolamine-binding protein，PEBP)和Raf 激酶抑制劑蛋白(Raf kinase inhibitorprotein，RKIP)相似，包含單一保守的PEBP/RKIP 結(jié)構(gòu)域。近年來，從植物中發(fā)現(xiàn)了大量的PEBP家族基因，例如在雙子葉植物擬南芥［6］、葡萄［7］、番茄［8］和楊樹［9］中發(fā)現(xiàn)有6～9 個，單子葉植物水稻［10］、小麥［10］和玉米［11］中的分別有19 個、20 個和24 個PEBP 家族基因。通過對植物PEBP 家族基因的系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)，PEBP 基因家族分為FT-like、MFT-like 和TFL1-like 3 個亞家族［11］。在植物PEBP 家族基因的研究中，F(xiàn)T-like 和TFL1-like 基因的研究相對較多，F(xiàn)T-like 基因是植物開花的誘導因子，也被認為可能是植物開花素的組分之一，具有促進開花的作用［12-13］，而TFL1-like 基因是花發(fā)育的抑制基因，能夠維持植物的營養(yǎng)生長和花序的無限生長狀態(tài)［14-16］，而MFT-like 基因在植物中研究還很少，其功能還知之尚少，可能有冗余的成花誘導作用，還可能與種子的發(fā)育有關［11，17］。由于PEBP 家族基因在植物發(fā)育特別是營養(yǎng)生長到生殖生長發(fā)育轉(zhuǎn)變過程中的調(diào)控作用及在植物育種中的應用前景，其功能研究及作用機制成為目前研究熱點之一。隨著擬南芥和水稻等模式植物分子生物學研究的不斷深入，人們對PEBP 家族基因在植物發(fā)育過程中的作用有了進一步認識，但是不同植物中具有多個PEBP 家族基因，多數(shù)基因的功能還不清楚，其蛋白的作用機制還不明確，因此為了更加清楚地了解植物PEBP 家族基因的作用機制，需要深入研究PEBP 家族基因在不同植物中的功能。

文心蘭為蘭科(Orchidaceae)文心蘭屬(Oncidium)，又名舞女蘭，由于其花形優(yōu)美、花色亮麗，具有良好的觀賞價值，近年來在國際及國內(nèi)花卉市場倍受青睞，是洋蘭類常見花卉，花期轉(zhuǎn)變的調(diào)控機制是研究的主要內(nèi)容，也是其栽培和育種的理論基礎。Hou 和Yang 從文心蘭(O.‘Gower Ramsey’)中鑒定出2 個PEBP 家族基因OnFT 和OnTFL1，與擬南芥的FT 和TFL1 同源，同時能夠調(diào)控文心蘭的成花轉(zhuǎn)變［18］。顯然，目前文心蘭PEBP 家族基因的研究還在起步階段，研究結(jié)果還不能對文心蘭PEBP 家族基因有全面認識。本研究以文心蘭雜交品種(Oncidium‘Sweet Sugar’)為材料，利用RT-PCR 技術(shù)克隆到一個PEBP 家族基因(OnTF-like)，采用RT-qPCR 方法，對文心蘭不同時期不同器官中OnTF-like 的表達量進行定量分析，并構(gòu)建了該基因的正義和反義表達載體。該研究結(jié)果有助于進一步闡明PEBP家族基因在文心蘭組織中的表達特性及分子調(diào)控機制，并為今后通過基因工程技術(shù)進行遺傳改良和種質(zhì)創(chuàng)新奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用文心蘭(O.Sweet Sugar)來自鄭州師范學院智能溫室，用文心蘭花蕾期葉片為材料進行基因克隆。另外分別取成苗期(沒有花葶抽出)、花蕾期(花葶抽出，有花蕾，無開花)、盛花期(花葶上大部分花蕾盛開)、花后期(開花過程結(jié)束，花枯萎脫落)的葉片、根、花葶、花瓣、柱頭、萼片等材料進行表達分析。所有材料取后迅速用液氮速凍，于-80 ℃冰箱備用。

1.2 總RNA 的提取及cDNA 第一鏈的合成

將文心蘭不同組織在液氮中研磨至粉狀，用Trizol(Invitrogen 公司)試劑提取其總RNA，用瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA 的完整性，以核酸蛋白分析儀(Q5000，Quawell，USA)測定其A260，A280值，計算RNA濃度和純度。以提取的總RNA 為模板，用M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶(TaKaRa 公司)合成cDNA，用于基因克隆;用PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)反轉(zhuǎn)錄成cDNA，將反轉(zhuǎn)錄的cDNA 稀釋5 倍備用于熒光定量檢測。

1.3 OnTF-like 基因序列的克隆與分析

根據(jù)GenBank 中已登錄AB052943(水稻)、AY705794(小麥)、AK376849(大麥)、NM_001112781(玉米)、GU324590(黑麥)等序列，采用Primer Premier5.0 設計1 對引物，PEBP-F:5'-ATG GCC GGT AGG GAT AGG G-3'和PEBP-R:5'-GCC GTG GGT AGA TCA ATT GTA CAT-3'，用于克隆基因的編碼區(qū)序列。其PCR 反應條件為:94 ℃預變性5 min，94 ℃變性40 s，59.5 ℃復性40 s，72 ℃延伸40 min，35個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)過凝膠回收，與pMD19-T vector(TAKARA)連接，轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細胞，經(jīng)藍白斑篩選及PCR 鑒定后送去測序。

已有序列的檢索使用GenBank 的Blast 在線分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/);系統(tǒng)進化樹使用MEGA4.0 軟件的Neighbor-joining 法建成。

1.4 qRT-PCR 分析

根據(jù)基因的全長設計1 對定量引物qRT-F:5'-TCGTGATGGTAGACCCAGATG-3＇和qRT-R:5'-GCTCTCATAGCACATCACTTCCT-3';以文心蘭的GAPDH 基因(GenBank 登錄序列號為:JN981141)作為內(nèi)參基因，其引物設計為qRT-GF:5'-GCTGCTAAGGCTGTGGGTA-3'和qRT-GF:5'-CTTGCCCTCAGACTCTTCCT-3'。采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡkit(TaKaRa)，反應體系為25 μL，反應程序為:94 ℃預變性1 min，94 ℃變性15 s，56 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s，40 次循環(huán)，每次循環(huán)的第3 步進行熒光采集。qRT-PCR 反應在Eppendorf Mastercycler 熒光定量PCR 儀上進行，3 次技術(shù)重復，2 次生物學重復，并做陰性對照。通過溶解曲線和擴增曲線確定引物的特異性。試驗輸出的數(shù)據(jù)用Microsoft Excel進行分析處理。目的基因相對表達量Rel.Exp=2-ΔΔCt，其中ΔCt=Ct(OnTF-like)-Ct(GAPDH)，ΔΔ Ct=(各植物組織ΔCt)-(苗期葉ΔCt)

1.5 OnTF-like 基因正義和反義植物表達載體的構(gòu)建

將正向引物PEBP-F 的5＇端分別引入Bgl II 和Nhe I 限制性內(nèi)切酶，將反向引物PEBP-R 的5＇端分別引入Nhe I 和Bgl II 限制性內(nèi)切酶，以1.3 步驟中插入OnTF-like 片段的pMD19-T 質(zhì)粒為模板，進行PCR 擴增，用于構(gòu)建正義和反義表達載體。PCR 反應程序為:94 ℃變性5 min;94 ℃變性35 s，59.5℃退火35 s，72 ℃延伸40 min，35 個循環(huán);72 ℃延伸10 min。將目的片段連接到pMD19-T 載體上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α 菌株，測序進行ORF 序列驗證，得到的陽性質(zhì)粒分別命名為pMD-OnTF-like-S 和pMD-OnTF-like-A。

以改造的pCAMBIA1301 質(zhì)粒(修改了Nco I 酶切位點)為表達載體，將pCAMBIA1301 用Bgl II 和Nhe I 限制性內(nèi)切酶不完全消化，回收pCAMBIA1301 質(zhì)粒經(jīng)酶消化后的9 844 bp 的載體片段，再分別將pMD19-OnTF-like-S 和pMD19-OnTF-like-A 質(zhì)粒用Bgl II 和Nhe I 限制性內(nèi)切酶徹底消化，獲得558 bp的目的基因片段。將回收的表達載體片段與目的基因片段經(jīng)T4 連接酶16 ℃過夜連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細胞，篩選陽性菌落，重組質(zhì)粒命名為1301-OnTF-like-S(正義植物表達載體)和1301-OnTF-like-A(反義植物表達載體)，提取質(zhì)粒后以限制性內(nèi)切酶Sph I 酶切鑒定，預期獲得8 632 bp 和1 757 bp 2 條片段，酶切鑒定正確的質(zhì)粒再次測序驗證。

2 結(jié)果與分析

2.1 OnTF-like 基因序列的克隆

以文心蘭花蕾期葉片的總RNA 為模板，利用引物PEBP-F 和PEBP-R 進行PCR 擴增，得到預期546 bp 的片段，此片段包含一個531 bp 的開放閱讀框，編碼177 個氨基酸(圖1)。在NCBI 上進行Blastn 分析，發(fā)現(xiàn)此序列與大花蕙蘭(Cymbidium hybrid，KF669643)、蝴蝶蘭(Phalaenopsis hybrid，KC138805)的FT-like 基因有99%的相似性、與萼脊蘭(Sedirea japonica，KF669644)和小麥(Triticum aestivum，AY705794)的TaFT 基因有98%的相似性，故將此基因命名為OnTF-like，登錄號為KF669642，蛋白登錄號為AHB86975。

圖1 OnTF-like 基因的核苷酸序列和推測的氨基酸序列Fig.1 The nucleotide acid sequence and deduced amino sequence of OnTF-like gene

2.2 OnTF-like 基因的氨基酸序列比對及其系統(tǒng)發(fā)育分析

圖2 OnTF-like 蛋白保守結(jié)構(gòu)域Fig.2 OnTF-like conservative protein domain structure

利用NCBI 中的BLASTx 工具把OnTF-like 的核酸序列翻譯成氨基酸序列，通過蛋白的功能結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，該氨基酸序列包含一個PEBP 功能域(圖2)。序列比對分析表明，OnTF-like 的氨基酸序列與小麥TaFT(ACA25439)、山羊草(Aegilops tauschii)FT(ABI34864)、蝴蝶蘭FT(AGE45850)，萼脊蘭SePEBP(AHB86977)，大麥(Hordeum vulgare subsp)HvFT1(AAZ38709)的同源性為99%，與黑麥草FT3(Lolium perenne，CBN73215)和草甸羊茅(Festuca pratensis)FT3(CBN73209)的同源性為97%，與高粱(Sorghum bicolor)的預測蛋白PEBP(XP_002436509)同源性為96%，與玉米(Zea mays)ACN15(NP_001106252)同源性為94%，與野生稻(Oryza rufipogon)Hd3a(BAO03052)的同源性為92%。與Hou 和Yang 報道的OnFT(EU583502)核苷酸序列具有69.41%的相似性，氨基酸序列具有78.535 相似性。

圖3 OnTF-like 氨基酸的系統(tǒng)進化樹分析Fig.3 Phylogenetic tree of OnTF-like amino acid sequences

為更好地了解OnTF-like 與其它PEBP 家族基因之間的進化關系，選取有代表性的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖3)。結(jié)果表明所分析的PEBP 蛋白明顯分為FT-like、MFT-like 和TFL1-like 3 個亞家族。文心蘭OnTF-like 氨基酸屬于FT-like 亞家族基因編碼，與蘭科植物蝴蝶蘭(Phalaenopsis hybrid)FT(AGE45850)親緣關系最近，與雙子葉植物擬南芥(Arabidopsis thaliana)的FT(AB027504)親緣關系最遠，而與文心蘭(Oncidium Gower Ramsey)的另一FT 基因(EU583502)和蕙蘭(Cymbidium faberi)的FT(HQ164434)關系也較遠，說明PEBP 亞家族成員存在種屬特異性，同時也可以看出同一物種的同一類PEBP 亞家族成員序列存在較大差異，可能與其不同的功能有關。

2.3 OnTF-like 基因的表達分析

為分析文心蘭OnTF-like 基因在植株發(fā)育過程中不同組織中的表達特性，以成苗期、花蕾期、盛花期和花后期4 個時期的根、葉、花葶及盛花期的花萼、側(cè)瓣、唇瓣和蕊柱等14 個組織的總RNA 為模板，進行實時熒光定量檢測。結(jié)果見圖4，可以看出文心蘭OnTF-like 在所有時期的根和花器官組織中沒有檢測到表達，在盛花期、花后期的葉片和花葶中也沒有表達，而在苗期的葉片及花蕾期的葉片和花葶中檢測到表達，其中花蕾期的花葶中表達水平最高，苗期的葉片中表達水平最低。由此推測，文心蘭OnTF-like 基因參與營養(yǎng)生長向生殖生長的轉(zhuǎn)變，與開花進程有關，而與花器官發(fā)育無關。

圖4 OnTF-like 基因的表達特性分析Fig.4 Analysis on the expression level of OnTF-like gene

2.4 正義和反義植物表達載體的構(gòu)建

利用引入限制性內(nèi)切酶Bgl II 和Nhe I 的引物從插入OnFT-like 基因的pMD19-T 克隆載體上擴增ORF 目的片段(圖5a)，凝膠回收后再次鏈接pMD19-T，并轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細胞，經(jīng)過篩選得到的陽性質(zhì)粒pMD19-OnTF-like-S 和pMD19-OnTF-like-A。將pCAMBIA1301 質(zhì)粒Bgl II 和Nhe I 酶切消化，切膠回收約9 830 bp的片段大片段(圖5b)，質(zhì)粒pMD19-OnFT-S 和pMD19-OnFT-A 經(jīng)Bgl II 和Nhe I限制性內(nèi)切酶酶切消化后，切膠回收小片段(圖5b)。將回收的pCAMBIA1301 載體片段與pMD19-On-FT-S 和pMD19-OnFT-A 的小片段用T4 DNA 連接酶連接，然后轉(zhuǎn)入DH5α 感受態(tài)細胞。重組質(zhì)粒經(jīng)過Sph I 酶切鑒定(圖5c)及測序驗證，成功構(gòu)建了正義植物表達載體1301-pMD19-OnFT-S 和反義植物表達載體1301-pMD19-OnFT-A(圖6)。

圖5 OnFT-like 表達載體的構(gòu)建及酶切鑒定Fig.5 Construction and restriction enzyme digestion of expression vectors of OnFT-like

圖6 植物表達載體構(gòu)建示意圖Fig.6 The schematic of the plant expression vector construction

3 討論

本研究通過RT-PCR 的方法，從文心蘭雜交種‘Sweet Sugar’中克隆了1 個PEBP 家族基因，該基因編碼177 個 氨基酸，具有典型的PEBP 蛋白結(jié)構(gòu)域，氨基酸序列比對分析表明，該基因?qū)儆贔T-like 亞家族，與許多單子葉植物的FT 類基因具有90%以上的相似性，其中與蝴蝶蘭、小麥、黑麥草、山羊草、萼脊蘭、大麥等的FT 類基因具有99%以上的相似性;可見該基因的氨基酸序列高度保守。而該基因與曾報道的文心蘭(O.Gower Ramsey)OnFT 序列差異相對較大［18］，說明了文心蘭PEBP 基因的FT-like 亞家族中具有多個成員，這個結(jié)果與水稻、玉米和小麥等具有多個PEBP 家族基因結(jié)果一致［10-11］。

文心蘭OnFT-like 基因在根中沒有表達，在成苗期的葉片中有表達，結(jié)果與OnFT 的表達分析一致。據(jù)報道，文心蘭OnFT 基因除了在幼苗期的葉片和成苗期的葉片中表達外，在花蕾及部分花器官中也有表達［18］，說明文心蘭OnFT 基因與本研究的OnFT-like 基因功能有很大差異，也進一步說明，二者基因序列的差異不僅僅是品種的差異，更主要的是PEBP 家族及FT-like 亞家族基因功能分化的差異，但二者的研究也表明，盡管表達特性有所不同，但都與開花進程有關，說明FT-like 亞家族基因功能也具有保守性。玉米［11］、墨蘭［19］、大麥［17］及挪威云杉［20］等多個研究也表明PEBP 家族成員表達特性和功能具有差異，大部分基因能夠直接或間接影響開花時間和花序形態(tài)，同時其功能也受光周期的影響，而文心蘭作為蘭科植物，一般認為其開花主要受溫度調(diào)控，與光周期的關系不大，其開花進程受哪些PEBP 基因的調(diào)控及它們在開花進程中是否也受光周期的影響是值得深入研究的課題。

本研究結(jié)果表明，文心蘭OnFT-like 基因在蕾期花葶中高表達，與開花進程有關，而在盛花期和花后期的花葶中沒有檢測到表達，又說明不具維持開花的功能，而該基因的具體功能及其調(diào)控機制如何，有待于進一步研究。本實驗室正在嘗試利用正義和反義基因技術(shù)研究文心蘭OnFT-like 基因的過量表達和反義RNA 干擾對植物發(fā)育的影響，最終揭示其在生殖發(fā)育中的調(diào)控作用。本研究已成功構(gòu)建正義和反義植物表達載體，為進一步探討文心蘭OnFT-like 基因的功能及調(diào)控機制奠定基礎，也為創(chuàng)造出更具觀賞價值的早花品種提供技術(shù)支持。

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