紫扁豆花色苷提取工藝及樹脂初步純化研究

陸 慶，蔣 艷，許小向，洪艷平*，尹小莉，閔嗣璠

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，江西省天然產(chǎn)物與功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330045;2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 圖書館，江西 南昌 330045)

紫扁豆(Lablab purpureus)，豆科植物，多年生或1 年生纏繞藤本植物，外觀紫色，常食用其嫩莢或成熟豆粒。扁豆含有包括蛋白質(zhì)、脂肪、糖類、鈣、磷、鐵及食物纖維、維A 原、維生素B1、維生素B2、維C等多種營養(yǎng)成分，且扁豆衣中富含B 族維生素［1］?；ㄉ帐腔ㄇ嗨嘏c糖類物質(zhì)以糖苷鍵結(jié)合而成的一類化合物，為廣泛存在于蔬菜、水果等食物中的天然色素，屬植物化學(xué)成分中的黃酮類化合物，具有抗氧化［2］、抗炎癥［3］、抗腫瘤［4］、抗動(dòng)脈粥樣硬化［5］等廣泛、優(yōu)異的生物活性，特別是其抗腫瘤活性以天然、低毒、高效而備受關(guān)注，已被廣泛用于食品、保健品、化妝品、醫(yī)藥等行業(yè)。紫扁豆中的色素主要為花色苷，人們可經(jīng)日常食用途徑攝入而起到一定的保健功能。大孔樹脂因其理化性質(zhì)穩(wěn)定、分離性能優(yōu)良、溶劑用量少等優(yōu)點(diǎn)而應(yīng)用于天然植物活性成分的提取分離［6-7］，利用大孔吸附樹脂純化天然植物花色苷多見于紫甘薯［8］、紫甘藍(lán)［9］、藍(lán)莓果［10］等紫紅色果蔬。目前，關(guān)于紫扁豆花色苷提取及其純化方面的研究未見報(bào)道。作者在研究扁豆花色苷提取工藝并進(jìn)行含量測(cè)定基礎(chǔ)上，以大孔樹脂進(jìn)行初步純化，旨在為人們深入了解紫扁豆的食用價(jià)值或開發(fā)利用提供理論依據(jù)和科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

紫扁豆(Lablab purpureus)，秋季購于江西農(nóng)業(yè)大學(xué)市場(chǎng)，干燥粉碎后備用。

試劑:無水乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、氯化鉀、醋酸鈉等均為分析純?cè)噭?樹脂:AB-8、X-5、DM-20、DM-21、DM-21D、DM-28、DM-2，山東魯抗立科藥業(yè)有限公司。

1.2 儀器

Q-350B3 型高速粉碎機(jī)上海冰都電器有限公司;GPX-9248A 型干燥箱/培養(yǎng)箱(兩用)，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司;玻璃反應(yīng)釜、W-O 恒溫油水浴鍋，上海申順生物科技有限公司;數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-4，常州國華電器有限公司;FA2104V 型電子天平，上海青浦儀器有限公司;V-5600 型可見分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司;SHZ-D(Ⅱ)型循環(huán)水式真空泵，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;TDL-5-A 型低速大容量離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 紫扁豆花色苷提取 準(zhǔn)確稱取紫扁豆粉末3.0 g，加入酸性乙醇溶液，根據(jù)試驗(yàn)條件回流浸提完成后，將所得提取液抽濾，濾液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀40 ℃減壓濃縮除去酒精，所得溶液定容于100 mL 具塞棕色容量瓶中4 ℃冷藏保存。

1.3.2 花色苷含量測(cè)定(1)緩沖液的配制。pH 1.0 緩沖液:稱取1.49 g KCl 定容100 mL，1.7 mL HCl定容100 mL，按體積比KCl∶HCl=25∶67 配置。pH 4.5 緩沖液:稱取2.72 g NaAc·3H2O 定容100 mL，HCl 調(diào)pH。

(2)紫扁豆花色苷最大吸收波長的確定。取一定量紫扁豆提取液用酸性乙醇溶液稀釋至一定體積，使其吸光值在一定范圍內(nèi)，在400～600 nm 波長范圍內(nèi)掃描，繪制吸收光譜圖。

(3)平衡時(shí)間的確定。因花青素在溶液介質(zhì)中存在4 種結(jié)構(gòu)形式，這些結(jié)構(gòu)在一定pH 下常處于一種動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)pH 改變時(shí)，動(dòng)態(tài)平衡發(fā)生移動(dòng)，總的趨勢(shì)是pH 降低時(shí)，平衡向紅色的2-苯基苯并吡喃陽離子移動(dòng)，pH 升高時(shí)，平衡向藍(lán)色的醌式移動(dòng)，一定時(shí)間后達(dá)到一個(gè)新的平衡［11］。因此色素溶液用緩沖液稀釋后，須靜置一段時(shí)間，等動(dòng)態(tài)平衡穩(wěn)定后，測(cè)吸光值。

(4)紫扁豆花色苷提取得率(以紫扁豆干重計(jì))的測(cè)定。采用pH 示差法［12-13］，移取2 mL 待測(cè)液分別用pH 1.0 和pH 4.5 的緩沖液定容到10 mL，放置一定時(shí)間平衡后，波長538 nm 和700 nm 處測(cè)定吸光值。

式中:A=(A538nm-A700nm)pH1.0-(A538nm-A700nm)pH4.5;Mw是矢車菊花素-3-葡萄糖苷的相對(duì)分子質(zhì)量449.2;ε 是矢車菊花素-3-葡萄糖苷消光系數(shù)26 900;L 為光程1 cm;Df 為稀釋因子;V 為最終體積，mL;Mt 為樣品質(zhì)量。

1.3.3 紫扁豆花色苷提取工藝單因素試驗(yàn)和正交設(shè)計(jì)試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取3.0 g 紫扁豆粉末5 份，分別考察了pH(1、2、3、4、5)、料液比(1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16)、提取溫度(40、50、60、70、80 ℃)、乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)(30%、40%、50%、60%、70%)、提取時(shí)間(45、60、75、90、105 min)5 個(gè)因素對(duì)紫扁豆花色苷提取得率的影響。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以料液比、提取溫度、乙醇濃度、提取時(shí)間為因素，進(jìn)行正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，得出紫扁豆花色苷提取的最優(yōu)條件。

1.3.4 優(yōu)化條件下的提取級(jí)數(shù)實(shí)驗(yàn) 在正交設(shè)計(jì)得出的最優(yōu)條件下分別采用級(jí)數(shù)為1，2，3 做提取試驗(yàn)，確定不同提取級(jí)數(shù)對(duì)紫扁豆花色苷提取得率的影響。

1.3.5 優(yōu)化條件下提取的重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 在正交設(shè)計(jì)得出的最優(yōu)條件下做重復(fù)性提取試驗(yàn)，確定提取條件的可行性和重現(xiàn)性。

1.3.6 樹脂靜態(tài)純化及色價(jià)的測(cè)定 (1)最佳樹脂的篩選。分別稱取已活化處理的各種樹脂0.5 g，置于250 mL 具塞錐形瓶中，加入pH3，0.171 9 mg/mL 花色苷粗提液50 mL，蓋緊瓶塞。室溫(10 ℃)靜置24 h 吸附飽和，吸取上清液測(cè)定其吸光度A1。將吸附飽和樹脂抽濾去除水分，各稱取0.5 g 置于250 mL具塞錐形瓶中，加入50 mL pH3.0 的80%乙醇溶液解吸24 h，吸取上清液測(cè)定其吸光度A2。

(2)樹脂靜態(tài)純化。樹脂按文獻(xiàn)［14］預(yù)處理，經(jīng)靜態(tài)吸附-解吸試驗(yàn)得到最佳的吸附-解吸條件，將最佳條件下純化后的溶液真空干燥后用于色價(jià)測(cè)定。

(3)色價(jià)的測(cè)定［15］。稱取適量純化并經(jīng)真空干燥后的紫扁豆花色苷，用pH 3.0 的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液稀釋定容至100 mL，在最大吸收波長處測(cè)定吸光值。

式中:A 為最大吸收波長處吸光值;m 為稱取樣品的質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫扁豆花色苷提取液光譜掃描圖譜

紫扁豆花色苷提取液經(jīng)紫外可見分光光度計(jì)掃描后的光譜圖見圖1。由圖1 可知紫扁豆花色苷的最大吸收波長為538 nm。

2.2 平衡時(shí)間的確定

由表1 可知，在pH 1.0 的緩沖液中，樣液的吸光值隨時(shí)間的延長而增大，150 min 時(shí)達(dá)平衡;在pH 4.5 的緩沖液中，樣液的吸光值隨時(shí)間的延長而增大，150 min 時(shí)達(dá)平衡。所以，平衡時(shí)間選擇150 min。

2.3 不同因素對(duì)紫扁豆花色苷提取效果影響

圖1 紫扁豆花色苷光譜掃描圖Fig.1 Spectrum scanogram of anthocyanins from Lablab purpureus

圖2(a)表明，隨著乙醇溶液的pH 不斷增大，提取液中花色苷提取得率在pH 3 時(shí)達(dá)到最高，隨后有所下降，說明花色苷在酸性條件下較穩(wěn)定，故提取溶劑為pH 3 為較佳pH 值;從圖2(b)結(jié)果看出，料液比增大到1∶12 后，花色苷的提取得率趨于平緩，綜合考慮經(jīng)濟(jì)效率因素，確定1∶12 為較合適料液比;隨浸提溫度的升高利于花色苷的浸出，在60 ℃下提取液中花色苷得率達(dá)最高，然而溫度升高后提取液中花色苷含量有所下降［圖2(c)］，這可能與較高溫度下導(dǎo)致花色苷結(jié)構(gòu)破壞有關(guān)，從花色苷化學(xué)結(jié)構(gòu)角度分析，加熱時(shí)，因?yàn)樗{(lán)色的醌式堿(A)、紅色的氧鎓離子(AH+)之間是可逆的，平衡向形成查爾酮的方向移動(dòng)，結(jié)果使顯色物質(zhì)(AH+和A)含量降低［16］;圖2(d)結(jié)果顯示，不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)乙醇提取液中花色苷含量在30%～60%范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%時(shí)達(dá)最高，乙醇濃度增大后其極性下降不利于極性較大的花色苷溶出;從提取時(shí)間對(duì)花色苷提取得率的影響［圖2(e)］可以看出，溶液中花色苷呈先升后降的趨勢(shì)，天然色素不穩(wěn)定，隨提取時(shí)間的延長，花色苷可能被氧化導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)骨架發(fā)生變化而使其含量降低，因此選擇75 min 為較合適的提取時(shí)間。

表1 平衡時(shí)間的確定Tab.1 Determination of the equilibrium time

圖2 pH、料液比、溫度、乙醇濃度、時(shí)間對(duì)紫扁豆花色苷提取得率的影響Fig.2 Effect of pH value，solid-liquid ratio，extraction temperature，ethanol concentration，extraction time on yield of anthocyanins

2.3.1 正交試驗(yàn)結(jié)果 為使提取條件進(jìn)一步優(yōu)化，得到理想的提取效果，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，pH 確定為3，設(shè)定正交試驗(yàn)因素水平表(表2～表5)。

表2 正交試驗(yàn)因素水平Tab.2 Levels and factors of L9(34)orthogonal test

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)處理Tab.3 The design and results of orthogonal test

表4 正交設(shè)計(jì)方差分析Tab.4 Analysis of variance

表5 正交試驗(yàn)Duncan 法多重比較結(jié)果Tab.5 Result of Duncan multiple comparison for the orthogonal test

在正交實(shí)驗(yàn)中(表3)第5 組組合方案A2B2C3D1得到的花色苷提取得率達(dá)到0.723 6 mg/g，與綜合Duncan 多重比較和極差分析(表4，5)所得最優(yōu)水平組合A3B3C3D1不符，分別對(duì)A2B2C3D1和A3B3C3D1進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，花色苷提取得率分別為0.731 1 mg/g 和0.689 4 mg/g，所以最終確定紫扁豆最佳提取工藝參數(shù)為A2B2C3D1，即乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%，料液比1∶12，提取溫度70 ℃，提取時(shí)間60 min。極差分析可知，影響紫扁豆花色苷提取得率各因素主次關(guān)系依次為:提取時(shí)間(D)、提取溫度(C)、乙醇濃度(A)、料液比(B)。

表6 提取級(jí)數(shù)試驗(yàn)結(jié)果Tab.6 The result of extraction series

2.3.2 提取級(jí)數(shù)及提取重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表6 可知，提取第1 次后紫扁豆花色苷提取得率較高，經(jīng)計(jì)算，提取1 次已達(dá)到3 次提取得率總和的93.8%，所以試驗(yàn)確定提取級(jí)數(shù)為一級(jí)。

由表7 可知，試驗(yàn)測(cè)得的結(jié)果變異系數(shù)為1.04%，表明重現(xiàn)性較好，試驗(yàn)得出的最優(yōu)組合方法是正確可行的。

2.4 最佳樹脂篩選

7 種樹脂的靜態(tài)吸附與解吸實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表8 所示。由表8 可知，DM-28 樹脂優(yōu)勢(shì)顯著，吸附和解吸相比其他6 種樹脂效果好，可能是由于DM-28 樹脂顆粒較小，具有較大比表面的比表面積，所以選定DM-28 為最佳樹脂。

2.5 紫扁豆花色苷樹脂初步純化結(jié)果

經(jīng)初步的DM-28 樹脂靜態(tài)吸附-解吸，確定樹脂DM-28 為純化紫扁豆花色苷的最佳樹脂。紫扁豆花色苷純化前色價(jià)為2.1，純化后色價(jià)提高到10.3，是純化前的4.9 倍。

表7 重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果Tab.7 The result of repeat test

表8 7 種大孔樹脂靜態(tài)吸附與解吸性能比較Tab.8 Comparison of the absorption and desorption properties of seven different macroporous resin

3 結(jié)論

通過單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化了紫扁豆花色苷最佳提取工藝條件，選擇pH 為3，提取乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%，料液比1∶12，提取溫度70 ℃，提取時(shí)間60 min，得到花色苷最大提取得率為0.733 1 mg/g。篩選出DM-28 為較適合純化紫扁豆花色苷的大孔樹脂，在靜態(tài)條件下，經(jīng)DM-28 樹脂吸附-解吸后，紫扁豆花色苷的色價(jià)純化后是純化前的4.9 倍。

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