免疫學(xué)標(biāo)記在細(xì)針穿吸甲狀腺橋本病診斷中的應(yīng)用

劉邦榮，陸 軍，張 偉，蔣 艷，張 巖，陳媛媛

(安徽省淮北市人民醫(yī)院，安徽淮北 235000)

橋本氏甲狀腺炎(Hashimot's thyroiditis，HT)是一種自身免疫性疾病，可伴發(fā)甲狀腺癌，近年來有逐年上升趨勢。甲狀腺細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)(FNAC)檢查由于簡單、快速、痛苦小，已成為診斷HT重要依據(jù)。據(jù)Doniach標(biāo)準(zhǔn)［1］將橋本甲狀腺炎按細(xì)胞學(xué)特點(diǎn)分為三個亞型即淋巴細(xì)胞型(lymphocytic subtype，LC)、嗜酸細(xì)胞型［oxyphil(cytology)subtype，OC］和纖維化型(fibrous subtype，F(xiàn)C)。橋本病顯微鏡下最顯著的特點(diǎn)是大量淋巴細(xì)胞浸潤。但是在工作中觀察到HT和結(jié)節(jié)性甲狀腺腫，在涂片中均能見到成小簇狀或三、五個密集排列細(xì)胞，核小、圓形或橢圓、或深染裸核較多見，是甲狀腺上皮，還是聚集地淋巴細(xì)胞，形態(tài)上往往難以區(qū)分［2］;而甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞乳頭狀增生和乳頭狀癌(PTC)的區(qū)別［3］，細(xì)胞學(xué)診斷也有難度。因此，本研究采用細(xì)胞涂片加做免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測CD45RO、Vimentin、HLA-DR、CK/Pan的表達(dá)，探討其在橋本病中的表達(dá)，為細(xì)胞病理學(xué)鑒別診斷提供依據(jù)。

1 對象和方法

1.1 研究對象 2009年1月至2011年12月我院內(nèi)分泌科門診及住院患者，經(jīng)FNAC證實(shí)細(xì)胞學(xué)類型僅為橋本甲狀腺炎共60例，男3例，女57例，年齡10～77歲。依據(jù)細(xì)胞學(xué)特點(diǎn)分淋巴細(xì)胞型23例，嗜酸細(xì)胞型29例，纖維化型8例。其中橋本病伴細(xì)胞不典型增生17例，橋本伴惡性病變3例。結(jié)節(jié)性甲狀腺腫對照10例，均從術(shù)后結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織中針吸;甲狀腺乳頭狀癌對照5例，均從術(shù)后病理組織中針吸獲取。全部病例均通過以下方式進(jìn)一步確診。(1)甲狀腺術(shù)后病理;(2)自身抗體測定陽性;(3)依據(jù)穿刺細(xì)胞學(xué)診斷并經(jīng)相應(yīng)的治療后好轉(zhuǎn)。未手術(shù)病例隨訪3年以上。

1.2 方法 首先要仔細(xì)觸診甲狀腺，確定具體穿刺部位和進(jìn)針方向?；颊呷∽?，局部用碘伏消毒，不必麻醉。持5 mL注射器接7號針頭，將針經(jīng)皮膚快速刺入甲狀腺或結(jié)節(jié)內(nèi)，然后在不同方向快速來回穿刺，待針座有成分時迅速拔出針頭，將抽吸物打在載玻片上，均勻涂開。待干后以95%酒精固定，HE及瑞氏染色。第二次將抽吸物注射到液基保存液中。離心沉淀后涂片備用。

選取甲狀腺細(xì)針抽吸標(biāo)本未染的涂片，采用SABC二步法，進(jìn)行免疫細(xì)胞染色，并做陽性對照。所用CD45RO、Vimentin、HLA-DR、CK/Pan，SP試劑盒購置北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

免疫細(xì)胞化學(xué)判定:以細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞膜上出現(xiàn)棕黃色顆粒且染色強(qiáng)度高于背景的非特異性著色為陽性。按陽性細(xì)胞所占百分?jǐn)?shù)并參考著色強(qiáng)度確定分級如下:將染色結(jié)果分為5個等級，無陽性細(xì)胞 (－);陽性細(xì)胞率5% ～25%(+);陽性細(xì)胞率26% ～50%(++);陽性細(xì)胞率51% ～75%(+++);陽性細(xì)胞數(shù)＞75%(++++)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料用例數(shù)、百分?jǐn)?shù)描述，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

10～29 歲共26人占43.3%，年輕人呈高發(fā)趨勢，見表1。

表1 60例橋本病不同的年齡分布及百分比

CD45RO、HLA-DR和Vimentin在60例HT和結(jié)節(jié)性甲狀腺腫細(xì)胞中的陽性表達(dá)情況見表2、圖1。

表2 CD45RO、HLA-DR和Vimentin在HT和結(jié)節(jié)性甲狀腺腫細(xì)胞中的陽性表達(dá)情況

圖1 CD45RO;Vimentin;HLA-DR;CK/Pan的表達(dá)情況

CK/Pan在橋本組60例中，共13例表達(dá)，陽性率占21.7%。其中細(xì)胞學(xué)診斷橋本病伴細(xì)胞不典型增生17例中，++以上陽性10例(10/17)，診斷惡性病變3例均強(qiáng)陽性(3/3)與術(shù)后組織病理一致，17例患者中6例術(shù)后診斷惡性，共9例占本組腫瘤發(fā)病率的15.0%(9/60)，對照組中5例均強(qiáng)陽性表達(dá)(5/5)詳見圖1。

3 討論

Welliams和Daniach統(tǒng)計(jì)40歲以上女性多見，但在本組中統(tǒng)計(jì)，20歲以下8例，10～29歲26例占43.3%，年輕人呈高發(fā)趨勢［4］。女性53例，占95%。因此，其發(fā)生病因可能與雌激素有關(guān)。雌激素可影響B(tài)淋巴細(xì)胞的抗原受體組合。動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，雄激素可抑制甲狀腺球蛋白接種后甲狀腺炎的發(fā)生，而雌激素則有促進(jìn)作用［5］。

3.1 CD45RO在HT中的表達(dá) HT是一種以T細(xì)胞為介導(dǎo)的甲狀腺自身免疫性疾病，在細(xì)胞學(xué)診斷中淋巴細(xì)胞型和嗜酸細(xì)胞型均可見大量淋巴細(xì)胞。淋巴細(xì)胞型中CD45RO標(biāo)記的淋巴細(xì)胞單抗陽性細(xì)胞++以上僅4例(4/23);嗜酸細(xì)胞型++以上24例(24/29);纖維化型中1例(1/8)。結(jié)節(jié)性甲狀腺腫++以上未見表達(dá)。CD45RO用來標(biāo)記抗原致敏過的淋巴細(xì)胞和記憶T細(xì)胞，只有活化和記憶T細(xì)胞才能在免疫損傷中發(fā)揮其作用。病變組織中浸潤的淋巴細(xì)胞未必都發(fā)生作用，因?yàn)榱馨图?xì)胞對抗原的識別是特異性的。薛婧報道［6］，CD45RO有11個 N-糖基化位點(diǎn)，由于糖基化位點(diǎn)的缺失，這種自我保護(hù)的機(jī)能被破壞導(dǎo)致甲狀腺自身免疫的損傷。10例結(jié)節(jié)性甲狀腺腫中，CD45RO表達(dá)呈+表達(dá)2例，但是，未見++以上表達(dá)。

3.2 HLA-DR在HT中的表達(dá) HLA(人類白細(xì)胞抗原)Ⅱ類抗原中，是最復(fù)雜的遺傳多態(tài)性系統(tǒng)。1989年郁忠勤報道DR與 HT病呈正相關(guān)［7］。正常人甲狀腺濾泡上皮(TEC)不表達(dá)HLA-DR抗原，而在HT患者甲狀腺組織內(nèi)，可見到TEC不同程度地表達(dá)HLA-DR抗原，因?yàn)镈R抗原在免疫應(yīng)答上具有抗原提呈，激活T淋巴細(xì)胞的作用，因此，在HT的免疫損傷中起了很重要的作用。在涂片中，淋巴細(xì)胞和甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞均有表達(dá)，DR表達(dá)的陽性++以上嗜酸細(xì)胞型21例(21/29)，纖維化型4例(4/8)，淋巴細(xì)胞型++2例(2/23)。通過DR在甲狀腺上皮的抗原異常表達(dá)程度，判斷自身免疫性甲狀腺疾病的診斷及病情發(fā)展?fàn)顩r。

3.3 Vimentin波形蛋白的表達(dá) 波形蛋白是一種中間絲蛋白，通常認(rèn)為在間葉組織細(xì)胞中表達(dá)，上皮來源細(xì)胞一般不表達(dá)，故被認(rèn)為是一種間葉成分特異性標(biāo)記物。在本組中，Vimentin表達(dá)的陽性程度上++以上嗜酸細(xì)胞型10例(10/29)，纖維化型中8例(8/8)，淋巴細(xì)胞型++以上均未見表達(dá)。通過年齡組發(fā)現(xiàn)在20歲以下的病例中未見表達(dá)。而在30歲以上患者中均不同程度的陽性表達(dá)。Vimentin反應(yīng)HT在疾病的進(jìn)展中，由于自身免疫的破壞使甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞不斷出現(xiàn)損傷而引起纖維組織增生［8］。

3.4 CK/Pan的表達(dá) 甲狀腺乳頭狀癌占甲狀腺癌的75%以上。CK/Pan是廣譜的細(xì)胞角蛋白抗體，是有低分子量AE1和高分子量AE3組成。單克隆抗體AE1能識別酸性家族的細(xì)胞角蛋白10、14、15、16和19;AE3單抗能與整個堿性家族的細(xì)胞角蛋白起反應(yīng)。主要定位以細(xì)胞膜為主，少量胞漿顯色。本組17例橋本伴不典型增生中，++以上陽性10例、，其中6例術(shù)后是乳頭狀癌。細(xì)胞學(xué)確診3例甲狀腺癌，CK/Pan表達(dá)強(qiáng)陽性與術(shù)后病理一致。HT病變中濾泡上皮細(xì)胞的增生與結(jié)節(jié)性甲狀腺腫的濾泡上皮細(xì)胞增生性質(zhì)不同，屬于不典型增生，與HT引起的免疫損傷和甲狀腺功能減退繼發(fā)TSH過度分泌對濾泡上皮細(xì)胞的持續(xù)刺激有關(guān)［9－10］。提示 HT 存在癌高發(fā)危險［11－12］。其中1 例患者女25歲，涂片中甲狀腺濾泡上皮乳頭狀增生，細(xì)胞異型不明顯，CK/Pan強(qiáng)陽性，手術(shù)后組織學(xué)確診為甲狀腺乳頭狀癌。對照組病例中1例有弱表達(dá)。因此，認(rèn)為細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢查加做CK/Pan，為臨床診治患者提供新的依據(jù)。

綜上所述，甲狀腺細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)合免疫細(xì)胞化學(xué)染色對診斷甲狀腺疾病提供新的思路?？捎兄贖T的分型及與其他甲狀腺疾病的鑒別，判斷疾病的發(fā)展程度。減少良性病變患者避免不必要的手術(shù)［13］。但是，由于甲狀腺血管豐富穿刺細(xì)胞數(shù)少，有效的細(xì)胞不能在涂片的固定位置。細(xì)胞容易掉片造成染色失敗。本組是將穿刺細(xì)胞放入液基保存液中，離心后可多制片，當(dāng)遇到掉片時可有涂片補(bǔ)充。另外，固定要及時，涂片做免疫標(biāo)記時以當(dāng)天效果最佳，盡量3 d內(nèi)完成。否則，容易細(xì)胞陽性模糊定位不準(zhǔn)。在操作時每一步延長5 min效果較好。免疫細(xì)胞技術(shù)為細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)發(fā)展帶來更廣闊的前景。

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