高效液相色譜法對水產(chǎn)品中蝦青素的測定

吳祥慶+黎小正+楊姝麗+吳明媛+謝宗升+陳靜+秦振發(fā)+黃鸞玉

摘要：建立水產(chǎn)品中蝦青素含量的高效液相色譜測定方法。樣品經(jīng)乙腈萃取、超聲提取、離心后，將上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、定容，用液相色譜-紫外檢測器檢測，外標(biāo)法定量。蝦青素濃度在0.02～10.00 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系好，相關(guān)系數(shù)0.999 5;加標(biāo)回收率為91.9%～95.8%，檢出限為10.00 μg/kg。該方法準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性好，易操作，適用于水產(chǎn)品中蝦青素含量的測定。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法;蝦青素;水產(chǎn)品

中圖分類號：O657.6 ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A ? ? ? ? ?文章編號：0439-8114（2014）20-4958-02

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.20.050

Determing Astaxanthin in Aquatic Products with HPLC

WU Xiang-qing，LI Xiao-zheng，YANG Shu-li，WU Ming-yuan，Xie Zong-sheng，Chen Jing，

QIN Zhen-fa，HUANG Luan-yu

（Fisheries Disease Prevention Environmental Monitoring and Quality Testing Center of Guangxi， Guangxi Academy of Fishery

Sciences， Nanning 530021， China）

Abstract： A HPLC method was developed to analyzed of astaxanthin in aquatic products. The samples were ultrasonically extracted with acetonitrile after centrifugation. The supernatant was evaporated and resolved. The determination was performed by HPLC with UV detector. The external calibration standard was used for quantification. The linear range was 0.02～10 μg/mL（R=0.999 5）with a good linearity. The recovery range was in 91.9%～95.8% with the detection limit of 10 μg/kg. The method is accurate， reproducible， easy for determing astaxanthin in aquatic products.

Key words： HPLC; astaxanthin; aquatic products

蝦青素（Astaxanthin）化學(xué)名稱為3，3′-二羥基-4，4′-二酮基-β，β′-胡蘿卜素，分子式為C40H52O4，廣泛存在于生物中，其抗氧化活性是維生素E的500倍以上[1，2]，具有抗腫瘤、降血脂以及增強(qiáng)人體免疫的功能[3，4]。蝦青素為海洋甲殼類動(dòng)物和魚類色素的主要成分，鮭魚、龍蝦等海產(chǎn)品紅潤的肉色即為蝦青素所體現(xiàn)，但人工養(yǎng)殖的水產(chǎn)品無法合成蝦青素，須在飼料中補(bǔ)給[5]。因此，目前蝦青素主要作為水產(chǎn)養(yǎng)殖的添加劑，廣泛應(yīng)用于黃顙魚、胡子鯰、大口鯰和甲魚等，是我國農(nóng)業(yè)部在1126公告（2008）中惟一允許使用的著色劑。蝦青素主要來源于人工合成和天然動(dòng)物提取，飼料中使用的蝦青素主要為人工合成品，合成蝦青素在組織中沉積率要高于天然色素[6]，且價(jià)格便宜。蝦青素的檢測方法包括薄層色譜法、分光光度法[7，8]、色譜法[9，10]。本試驗(yàn)建立高效液相色譜法測定水產(chǎn)品中蝦青素，方法操作簡單、結(jié)果準(zhǔn)確，適用于水產(chǎn)品中蝦青素定量測定。

1 ?材料與方法

1.1 ?儀器

Accela液相色譜儀（美國Thermo公司），配PDA檢測器;B-490旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（美國BUCHI公司）;TDD-4離心機(jī)（長沙平凡儀器儀表有限公司）;SK3300LH超聲儀（上?？茖?dǎo)儀器公司）。

1.2 ?試劑

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)蝦青素，純度≥98%，購于德國Dr. Ehrenstorfer公司。乙腈為色譜純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 ?方法

1.3.1 ?蝦青素標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 ?稱取蝦青素10 mg，用乙腈定容至100 mL，配成濃度為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，4℃避光保存。以乙腈為稀釋液，配制0～1 μg/mL系列濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液，臨用前配制。

1.3.2 ?樣品前處理 ?稱取5 g均質(zhì)樣品于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈，超聲提取2 min，勻漿提取30 s，4 000 r/min離心5 min。另取50 mL離心管加10 mL乙腈，洗滌勻漿刀頭10 s，合并洗滌液，漩渦30 s，超聲提取2 min，4 000 r/min離心5 min;合并上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用乙腈定容至10 mL，過0.22 μm濾膜，待上機(jī)分析。

1.3.3 ?色譜分析 ?色譜柱Hypersil GOLD C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.9 μm），0.2 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量20 μL，檢測波長475 nm;流動(dòng)相A為乙腈，B為去離子水。梯度洗脫程序見表1。在相同條件下，做空白試驗(yàn)，采用外標(biāo)法定量。

1.3.4 ?回收率分析 ? 稱取空白水產(chǎn)品5 g，分別添加3個(gè)水平的蝦青素標(biāo)準(zhǔn)溶液（10、50和100 μg/kg）按1.3.2和1.3.3分析，每個(gè)濃度水平重復(fù)6次。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

在上述色譜條件下，2.00 μg/mL蝦青素標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖如圖1所示。

將標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行色譜分析。以峰面積為縱坐標(biāo)，以蝦青素濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性方程為Y=4 605.3X-59 898，R=0.999 5，在0.02～10 μg/mL呈良好線性關(guān)系。

2.2 ?樣品測定

將樣品溶液按上述方法分析，記錄色譜峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中蝦青素含量，采用外標(biāo)法定量。

2.3 ?方法的準(zhǔn)確度和精密度

加標(biāo)回收和精密度試驗(yàn)結(jié)果見表2。由表2可知，蝦青素回收率為91.9%～95.8%，RSD為1.9%～4.7%。結(jié)果表明，加標(biāo)回收率為70.0%～120.0%，RSD<20%，準(zhǔn)確度和精密度符合技術(shù)要求，可用于水產(chǎn)品中蝦青素含量測定。

2.4 ?方法檢出限

以空白水產(chǎn)品為基質(zhì)加標(biāo)，按照3倍信噪比估算最低檢出限，本方法檢測限為10 μg/kg。

3 ?小結(jié)

本試驗(yàn)采用乙腈萃取、超聲提取、離心等步驟處理水產(chǎn)品，獲得樣品提取液，以乙腈和水為流動(dòng)相，實(shí)現(xiàn)水產(chǎn)品中蝦青素的定量分析，該方法操作簡單，消耗少，靈敏度、精密度高，回收率好，可滿足水產(chǎn)品中蝦青素含量定量檢測要求。

參考文獻(xiàn)：

[1] KRUASHIGE M， OKIMASU M， UTSUMI K. Inhibition of oxidative injury of biological membranes by astaxanthin[J]. Physiol Chem Phys Med，1990，22（1）：27-38.

[2] 裴凌鵬，惠伯棣，董?；?蝦青素改善D-半乳糖致衰大鼠抗氧化功能的研究[J].國外醫(yī)學(xué)（老年醫(yī)學(xué)分冊），2006，27（6）：283-286.

[3] ANDERSON M L. A preliminary investigation of the enzymatic inhibition of 5 alpha-reductase and growth of prostatic carcinoma cell line LNCap-FGC by natural astaxanthin and saw palmetto lipid extract invitro[J]. Journal of Herbal Pharmacotherapy，2005，5（1）：17-26.

[4] 彭光華，李 ?忠，張聲華，等.6種類胡蘿素對人乳腺癌細(xì)胞株細(xì)胞間隙連接通訊功能影響的比較[J].食品科學(xué)，2008，29（6）： 45-48.

[5] 於亞兵，楊志剛.蝦青素在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用[J].中國水產(chǎn)， 2007（6）：65-66.

[6] 孟現(xiàn)成，雷 ?劍.蝦青素在魚類餌料中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].河北漁業(yè)，2008，179（11）：1-9.

[7] TOLASA S， CAKLI S， OSTERMEYER U. Determination of astaxanthin and canthaxanthin in salmonid[J]. European Food Research and Technology，2005，221（6）：787-791.

[8] 許培雅，鄭裕國，沈寅初.分光光度法測定紅發(fā)夫酵母中蝦青素含量[J].浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，29（2）：120-135.

[9] 姜 ?淼，楊賢慶，李來好，等.高效液相色譜法測定蝦殼中的蝦青素[J].食品科學(xué)，2010，31（20）：371-375.

[10] 陳晉明，王世平，陳 ?敏.反相高效液相色譜法檢測蝦青素[J].化學(xué)分析計(jì)量，2006，15（2）：27-29.

1.3.4 ?回收率分析 ? 稱取空白水產(chǎn)品5 g，分別添加3個(gè)水平的蝦青素標(biāo)準(zhǔn)溶液（10、50和100 μg/kg）按1.3.2和1.3.3分析，每個(gè)濃度水平重復(fù)6次。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

在上述色譜條件下，2.00 μg/mL蝦青素標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖如圖1所示。

將標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行色譜分析。以峰面積為縱坐標(biāo)，以蝦青素濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性方程為Y=4 605.3X-59 898，R=0.999 5，在0.02～10 μg/mL呈良好線性關(guān)系。

2.2 ?樣品測定

將樣品溶液按上述方法分析，記錄色譜峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中蝦青素含量，采用外標(biāo)法定量。

2.3 ?方法的準(zhǔn)確度和精密度

加標(biāo)回收和精密度試驗(yàn)結(jié)果見表2。由表2可知，蝦青素回收率為91.9%～95.8%，RSD為1.9%～4.7%。結(jié)果表明，加標(biāo)回收率為70.0%～120.0%，RSD<20%，準(zhǔn)確度和精密度符合技術(shù)要求，可用于水產(chǎn)品中蝦青素含量測定。

2.4 ?方法檢出限

以空白水產(chǎn)品為基質(zhì)加標(biāo)，按照3倍信噪比估算最低檢出限，本方法檢測限為10 μg/kg。

3 ?小結(jié)

本試驗(yàn)采用乙腈萃取、超聲提取、離心等步驟處理水產(chǎn)品，獲得樣品提取液，以乙腈和水為流動(dòng)相，實(shí)現(xiàn)水產(chǎn)品中蝦青素的定量分析，該方法操作簡單，消耗少，靈敏度、精密度高，回收率好，可滿足水產(chǎn)品中蝦青素含量定量檢測要求。

參考文獻(xiàn)：

[1] KRUASHIGE M， OKIMASU M， UTSUMI K. Inhibition of oxidative injury of biological membranes by astaxanthin[J]. Physiol Chem Phys Med，1990，22（1）：27-38.

[2] 裴凌鵬，惠伯棣，董?；?蝦青素改善D-半乳糖致衰大鼠抗氧化功能的研究[J].國外醫(yī)學(xué)（老年醫(yī)學(xué)分冊），2006，27（6）：283-286.

[3] ANDERSON M L. A preliminary investigation of the enzymatic inhibition of 5 alpha-reductase and growth of prostatic carcinoma cell line LNCap-FGC by natural astaxanthin and saw palmetto lipid extract invitro[J]. Journal of Herbal Pharmacotherapy，2005，5（1）：17-26.

[4] 彭光華，李 ?忠，張聲華，等.6種類胡蘿素對人乳腺癌細(xì)胞株細(xì)胞間隙連接通訊功能影響的比較[J].食品科學(xué)，2008，29（6）： 45-48.

[5] 於亞兵，楊志剛.蝦青素在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用[J].中國水產(chǎn)， 2007（6）：65-66.

[6] 孟現(xiàn)成，雷 ?劍.蝦青素在魚類餌料中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].河北漁業(yè)，2008，179（11）：1-9.

[7] TOLASA S， CAKLI S， OSTERMEYER U. Determination of astaxanthin and canthaxanthin in salmonid[J]. European Food Research and Technology，2005，221（6）：787-791.

[8] 許培雅，鄭裕國，沈寅初.分光光度法測定紅發(fā)夫酵母中蝦青素含量[J].浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，29（2）：120-135.

[9] 姜 ?淼，楊賢慶，李來好，等.高效液相色譜法測定蝦殼中的蝦青素[J].食品科學(xué)，2010，31（20）：371-375.

[10] 陳晉明，王世平，陳 ?敏.反相高效液相色譜法檢測蝦青素[J].化學(xué)分析計(jì)量，2006，15（2）：27-29.

1.3.4 ?回收率分析 ? 稱取空白水產(chǎn)品5 g，分別添加3個(gè)水平的蝦青素標(biāo)準(zhǔn)溶液（10、50和100 μg/kg）按1.3.2和1.3.3分析，每個(gè)濃度水平重復(fù)6次。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

在上述色譜條件下，2.00 μg/mL蝦青素標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖如圖1所示。

將標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行色譜分析。以峰面積為縱坐標(biāo)，以蝦青素濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性方程為Y=4 605.3X-59 898，R=0.999 5，在0.02～10 μg/mL呈良好線性關(guān)系。

2.2 ?樣品測定

將樣品溶液按上述方法分析，記錄色譜峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中蝦青素含量，采用外標(biāo)法定量。

2.3 ?方法的準(zhǔn)確度和精密度

加標(biāo)回收和精密度試驗(yàn)結(jié)果見表2。由表2可知，蝦青素回收率為91.9%～95.8%，RSD為1.9%～4.7%。結(jié)果表明，加標(biāo)回收率為70.0%～120.0%，RSD<20%，準(zhǔn)確度和精密度符合技術(shù)要求，可用于水產(chǎn)品中蝦青素含量測定。

2.4 ?方法檢出限

以空白水產(chǎn)品為基質(zhì)加標(biāo)，按照3倍信噪比估算最低檢出限，本方法檢測限為10 μg/kg。

3 ?小結(jié)

本試驗(yàn)采用乙腈萃取、超聲提取、離心等步驟處理水產(chǎn)品，獲得樣品提取液，以乙腈和水為流動(dòng)相，實(shí)現(xiàn)水產(chǎn)品中蝦青素的定量分析，該方法操作簡單，消耗少，靈敏度、精密度高，回收率好，可滿足水產(chǎn)品中蝦青素含量定量檢測要求。

參考文獻(xiàn)：

[1] KRUASHIGE M， OKIMASU M， UTSUMI K. Inhibition of oxidative injury of biological membranes by astaxanthin[J]. Physiol Chem Phys Med，1990，22（1）：27-38.

[2] 裴凌鵬，惠伯棣，董?；?蝦青素改善D-半乳糖致衰大鼠抗氧化功能的研究[J].國外醫(yī)學(xué)（老年醫(yī)學(xué)分冊），2006，27（6）：283-286.

[3] ANDERSON M L. A preliminary investigation of the enzymatic inhibition of 5 alpha-reductase and growth of prostatic carcinoma cell line LNCap-FGC by natural astaxanthin and saw palmetto lipid extract invitro[J]. Journal of Herbal Pharmacotherapy，2005，5（1）：17-26.

[4] 彭光華，李 ?忠，張聲華，等.6種類胡蘿素對人乳腺癌細(xì)胞株細(xì)胞間隙連接通訊功能影響的比較[J].食品科學(xué)，2008，29（6）： 45-48.

[5] 於亞兵，楊志剛.蝦青素在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用[J].中國水產(chǎn)， 2007（6）：65-66.

[6] 孟現(xiàn)成，雷 ?劍.蝦青素在魚類餌料中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].河北漁業(yè)，2008，179（11）：1-9.

[7] TOLASA S， CAKLI S， OSTERMEYER U. Determination of astaxanthin and canthaxanthin in salmonid[J]. European Food Research and Technology，2005，221（6）：787-791.

[8] 許培雅，鄭裕國，沈寅初.分光光度法測定紅發(fā)夫酵母中蝦青素含量[J].浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，29（2）：120-135.

[9] 姜 ?淼，楊賢慶，李來好，等.高效液相色譜法測定蝦殼中的蝦青素[J].食品科學(xué)，2010，31（20）：371-375.

[10] 陳晉明，王世平，陳 ?敏.反相高效液相色譜法檢測蝦青素[J].化學(xué)分析計(jì)量，2006，15（2）：27-29.