新型產(chǎn)瓊膠酶海洋細(xì)菌的篩選和鑒定

劉麗莉+祖國(guó)仁

摘要：從大連沿海的50份石花菜中篩選出相對(duì)酶活較高的83株產(chǎn)瓊膠酶菌株（酶活力測(cè)定采用3， 5 - 二硝基水楊酸法），挑選瓊膠酶活力最高的菌株并通過(guò)形態(tài)學(xué)特征、生理生化特征及16S rRNA基因序列分析研究其分類地位。結(jié)果表明，該菌株（暫命名為ZGR-26）為革蘭氏陰性桿菌，與食瓊膠弧菌（Vibrio agarivorans）序列同源性達(dá)到99%，兩者生理生化特性基本相符，可初步確定為食瓊膠弧菌（Vibrio agarivorans）。篩選得到了新型的產(chǎn)瓊膠酶海洋細(xì)菌——食瓊膠弧菌（Vibrio agarivorans），分泌瓊膠酶活力較高（32.1 U/mL），為微生物降解法生產(chǎn)瓊膠寡糖提供了新的出發(fā)菌株。

關(guān)鍵詞：瓊膠酶;篩選與鑒定;16S rRNA;食瓊膠弧菌（Vibrio agarivorans）

中圖分類號(hào)：Q939 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ?文章編號(hào)：0439-8114（2014）20-4831-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.20.015

Screening and Identification of A Novel Marine Bacterium Producing Agarase

LIU Li-li， ZU Guo-ren

（ School of Biological Engineering， Dalian Polytechnic University， Dalian 116034， Liaoning， China）

Abstract： 83 agarase-producing strain with high enzyme activity were screened from 50 samples of Gelidium in Dalian coast by DNS method. The morphology， physiological characteristics and 16SrRNA sequence of the strains were identified to characterize its classification status. The results showed that the strain （named as ZGR-26） was Gram negative bacilli， had 99% homology and consistent physiological and biochemical characteristics with Vibrio agarivorans. The screened novel marine agarase-producing bacteria was identified as Vibrio agarivorans. The activity of producing agarase reached to 32.1 U/mL. It will provide a initial strain to agar- oligosaccharides manufacture by bio-degradation.

Key words： agarse; screening and identification;16SrRNA;Vibrio agarivorans

瓊脂又稱瓊膠，是一組海藻多糖的總稱，由半乳糖和3，6—內(nèi)醚—L-半乳糖通過(guò)1—3和1—4糖苷鍵交替連接的長(zhǎng)鏈，在C6上被硫酸酯化，是一類含硫酸酯的半乳聚糖[1]。天然瓊膠是一種從海洋藻類細(xì)胞壁中提取出來(lái)的多糖，其水解產(chǎn)物瓊膠低聚糖或瓊膠寡糖在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。瓊膠寡糖不受腸道內(nèi)細(xì)菌分解以及無(wú)熱量產(chǎn)生，因而可作高甜味劑的填充劑及分散劑用于飲料、面包及低熱量食品的生產(chǎn)[2]。瓊膠寡糖通過(guò)阻止可誘導(dǎo)性NO合成酶（iNOS）的表達(dá)來(lái)抑制過(guò)量NO自由基的產(chǎn)生，從而消除一些因NO過(guò)量而造成的關(guān)節(jié)炎等炎癥[3]。此外瓊膠低聚糖ML對(duì)自由基有很好的清除作用，小鼠試驗(yàn)表明中分子瓊膠低聚糖（ML）可保護(hù)抗氧化酶SOD和GSH—Px的活力，對(duì)肝損傷有良好的保護(hù)作用[4]。目前瓊膠寡糖的獲取途徑主要是通過(guò)化學(xué)降解法和酶解法，化學(xué)降解法存在條件難控制、產(chǎn)物不均一、產(chǎn)物分析和回收難等問(wèn)題。用微生物分泌的瓊膠酶水解瓊膠制備瓊膠寡糖，不僅反應(yīng)條件溫和，能耗低，且酶催化具有高效性和專一性，選擇性地切斷糖苷鍵，可克服化學(xué)降解法存在的問(wèn)題[5]。

目前絕大部分瓊膠酶來(lái)源于海洋生態(tài)系統(tǒng)中的海洋細(xì)菌，這類微生物分布范圍非常廣且其產(chǎn)酶量大。劉江濤等[6]從江蘺中分離得到了兩株多食鞘氨醇桿菌;田國(guó)強(qiáng)等[7]發(fā)現(xiàn)紅藻門(mén)江蘺和石花菜中共生有Agarivorans、Cellulophaga、Alteromonas、Saccharophagus、Glaciecola、Vibrio 6個(gè)屬的具有降解瓊膠能力的海洋細(xì)菌;除了在海洋生態(tài)系統(tǒng)以外，降解瓊膠的菌類也同樣存在陸地生態(tài)系統(tǒng)中，Suzuki 等[8]在日本岐阜地區(qū)的土壤中分離到一株能夠產(chǎn)生α-新瓊寡糖水解酶的芽孢桿菌（Bacillus sp.MK03） 。這些已發(fā)現(xiàn)的海洋細(xì)菌降解瓊膠能力普遍偏低，還遠(yuǎn)未能達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)瓊膠寡糖的需求，這也成為阻礙生物法制備瓊膠寡糖的瓶頸，本研究從海洋微生物中分離出高效降解瓊膠的菌株，為今后開(kāi)發(fā)利用海洋細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的多糖降解酶和對(duì)應(yīng)的功能基因生產(chǎn)功能性寡糖奠定基礎(chǔ);同時(shí)，為進(jìn)一步研究凝膠的寡糖成分、寡糖活性創(chuàng)造條件。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?菌株來(lái)源 ?大連黑石礁沿海海域自然生長(zhǎng)的石花菜。分離培養(yǎng)基（2216E）：蛋白胨5 g，酵母膏1 g，磷酸高鐵0.01 g，瓊脂20 g，陳海水1 000 mL，pH 7.2～7.8，121 ℃，20 min 滅菌后倒平板。種子培養(yǎng)基：瓊脂1 g，其他成分同分離培養(yǎng)基。發(fā)酵培養(yǎng)基：同種子培養(yǎng)基。

1.1.2 ?主要試劑及儀器 ?瓊脂及其他化學(xué)試劑均來(lái)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。JSM-460LV型掃描電鏡（英國(guó)牛津儀器公司），722型光柵分光光度計(jì)（上海分析儀器廠）。

1.2 ?方法

1.2.1 ?產(chǎn)瓊膠酶海洋細(xì)菌的分離 ?將采集的50份石花菜樣品用剪刀將其剪成細(xì)小碎片，置于含有玻璃珠的海水中振蕩30 min，取不同稀釋梯度的菌懸液涂布在分離培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)觀察。以能產(chǎn)生瓊脂凹陷圈為標(biāo)準(zhǔn)，挑取凹陷圈較大的菌株，單菌落斜面保藏以篩選產(chǎn)瓊膠酶性能優(yōu)良菌株。

1.2.2 ?產(chǎn)瓊膠酶性能優(yōu)良菌株的篩選 ?挑取篩選菌株一環(huán)，接入裝有5 mL種子培養(yǎng)基的大試管中， 28 ℃，150 r/min搖床培養(yǎng)24 h后，轉(zhuǎn)接到裝有30 mL/100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，28 ℃，150 r/min搖床培養(yǎng)48 h，取培養(yǎng)液于8 000 r/min離心5 min后，上清液以DNS法（3， 5 - 二硝基水楊酸法）[9]測(cè)量瓊膠酶活力。DNS法瓊膠酶活力測(cè)定方法：取1 mL發(fā)酵上清液和1 mL磷酸緩沖液（瓊脂0.2 g/L，pH 7.0）于試管內(nèi)，于40 ℃溫浴30 min后加入2mL DNS試劑，混合液在沸水中水浴10 min后用去離子水定容至25 mL，充分混勻后在540 nm處測(cè)量吸光度值。酶活力定義：以煮沸滅活的上清液為空白對(duì)照，以1 mL酶液1 min產(chǎn)1 μg還原糖定義為1個(gè)活力單位。

1.2.3 ?產(chǎn)瓊膠酶海洋細(xì)菌的電鏡形態(tài)觀察 ?電子掃描電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.4 ?產(chǎn)瓊膠酶海洋細(xì)菌鑒定 ?菌株的形態(tài)學(xué)和生理生化特性的測(cè)定： 根據(jù)《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》所列菌種鑒定的方法進(jìn)行菌種的鑒定[10]。菌株的16S rRNA基因序列測(cè)定和分析： ① 16S rRNA基因序列測(cè)定：由寶生物工程有限公司完成。②16S rRNA基因序列結(jié)果分析：將所得到的基因序列利用BLAST軟件與GenBank（www.ncbi.nlm.nih.gov）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)， 獲取相近典型菌株的16S rRNA基因序列， 采用ClustalX和MEGA軟件包進(jìn)行分析， 用鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)， 進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析， 各枝上的數(shù)字是1 000次Bootstrap重抽樣分析的支持百分比[11-13]。

2 ?結(jié)果

2.1 ?細(xì)菌分離結(jié)果

從50份石花菜樣本中分離得到83株菌株，根據(jù)瓊脂凹陷圈大小得到具有較明顯分解瓊脂能力的菌株30株（圖1A），經(jīng)盧哥氏碘液染色后產(chǎn)生透明圈（圖1B）。

2.2 ?高產(chǎn)瓊膠酶菌株的篩選

以初步分離得到的30株菌株為出發(fā)菌株，測(cè)得其48 h瓊膠酶活力（表1）。其中酶活力平均值在10以上的菌株有15株，酶活力最高菌株為ZGR-26菌株，達(dá)到32.1。由于這些菌株的菌落形態(tài)較為相似，認(rèn)為是同一種菌，所以選取產(chǎn)酶活力最高的ZGR-26菌株進(jìn)行鑒定。

2.3 ?產(chǎn)瓊膠酶菌株ZGR-26的形態(tài)、培養(yǎng)特征及理化特性

瓊膠酶產(chǎn)生菌ZGR-26在2216E固體培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后觀察， 菌落呈扁圓形凸起， 光滑， 比較濕潤(rùn)， 白色或淡黃色，透明，邊緣整齊， 無(wú)可溶性色素， 周邊分解瓊脂產(chǎn)生透明凹陷。電鏡觀察， 細(xì)胞短桿狀，（1.0～1.5） μm×（1.5～2.0） μm， 無(wú)芽孢， 革蘭氏染色陰性（圖2）。

ZGR-26的部分生理生化特征見(jiàn)表2。將該菌株與V. agarivorans進(jìn)行生理生化特征鑒定比較， 結(jié)果表明菌株ZGR-26所測(cè)定的生理生化反應(yīng)與V. agarivorans作為屬間種的鑒別的特征基本相符（但是ZGR-26能利用蔗糖作為碳源，而V. agarivoran則不能），由此初步鑒定該菌為食瓊膠弧菌。

2.4 ?16S rRNA基因序列分析

將擴(kuò)增得到的16S rRNA基因片段電泳檢測(cè)， 測(cè)得其序列長(zhǎng)度為1 458 bp。經(jīng)BLASTn軟件序列分析， 結(jié)果表明細(xì)菌ZGR-26 （KF612972）與食瓊膠弧菌（V. agarivorans）同源性最高（表3）。從GenBank中選取和菌株ZGR-26同源性較高的8株菌株的16S rRNA基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)， 結(jié)果顯示，ZGR-26的遺傳進(jìn)化距離與食瓊膠弧菌（V. agarivorans）最近， 并在同一分支中，而與此前發(fā)現(xiàn)較多的噬瓊膠菌（Agarivorans albus）進(jìn)化距離較遠(yuǎn)，不在同一進(jìn)化分支中（圖3）。根據(jù)菌株的形態(tài)學(xué)特征、生理生化特征和16S rRNA基因序列分析， 初步鑒定細(xì)菌ZGR-26為食瓊膠弧菌（V. agarivorans）。

3 ?討論

國(guó)內(nèi)外對(duì)于能降解瓊膠的海洋細(xì)菌的研究主要集中在噬瓊膠菌（Agarivorans albus）上，其中從榮螺腸道中分離得到的噬瓊膠菌株瓊膠酶基因已經(jīng)被測(cè)定出來(lái)，并在宿主大腸桿菌中得到成功表達(dá)[14]。本試驗(yàn)從石花菜中篩選得到了30株菌株的瓊膠酶活力，其中菌株ZGR-26酶活力達(dá)到32.1。經(jīng)16S rRNA基因序列分析表明，與已報(bào)道有明顯降解瓊脂能力的噬瓊膠菌（Agarivorans albus）進(jìn)化距離較遠(yuǎn)，而與食瓊膠弧菌（V. agarivorans）最為接近。菌株生理生化特征結(jié)果表明ZGR-26除了在利用蔗糖能力上與食瓊膠弧菌有所差別，其他特征基本一致，可以確定ZGR-26為食瓊膠弧菌（V. agarivorans）。此類瓊膠降解菌國(guó)內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)，國(guó)外僅Macisn等[15]從大西洋海水及蚌類中分離出食瓊膠弧菌（V. agarivorans），這為微生物生態(tài)多樣性研究奠定了基礎(chǔ)，這也為生物制備瓊膠寡糖提供了更為廣泛的研究材料，為大量制備高純度的低聚糖創(chuàng)造條件，在寡糖的基礎(chǔ)及應(yīng)用研究方面提供技術(shù)支撐，以及為海洋寡糖類創(chuàng)新藥物的研究開(kāi)發(fā)以及其相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展奠定理論基礎(chǔ)，對(duì)推動(dòng)糖生物學(xué)和化學(xué)研究的深入開(kāi)展具有重要意義。

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