一株拮抗姜瘟根際青枯假單胞桿菌的沙雷氏菌的分離與鑒定

李霞+張小平+李欣

摘要：從生姜連作地土壤中分離到1株對(duì)生姜青枯假單胞桿菌（Pseudomonas solanacarum Smith）有強(qiáng)拮抗作用的沙雷氏菌株R11，對(duì)該菌株進(jìn)行了形態(tài)特征、培養(yǎng)特征、生理生化和16S rDNA序列分析的系統(tǒng)鑒定，發(fā)現(xiàn)R11為革蘭氏陰性菌，端生一根鞭毛。以16S rDNA序列為基礎(chǔ)構(gòu)建了包括11株相關(guān)種屬細(xì)菌在內(nèi)的系統(tǒng)發(fā)育樹，R11與沙雷氏菌（Serratia sp.）十分接近，序列相似性值達(dá)99%。

關(guān)鍵詞：沙雷氏菌（Serratia sp.）;16S rDNA;青枯假單胞桿菌（Pseudomonas solanacarum Smith）

中圖分類號(hào)：Q939 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ?文章編號(hào)：0439-8114（2014）20-4841-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.20.018

Isolation and Identification of a Serratia sp. Strain Against Ginger Bacterial wilt Caused by Pseudomonas solanacarum Smith

LI Xia1，ZHANG Xiao-ping1， LI Xin2

（1.Institute of Mountain Hazards and Environment，Chinese Academy of Sciences，Chengdu 610041，China;2.Institute of Mordern Physics， Chinese Academy of Sciences， Lanzhou 730000，China）

Abstract：R11， isolated from soil of ginger in Sichuan Province， was effective in against ginger bacterial wilt caused by Pseudomonas solanacarum Smith. The morphological， cultural， physiological and biochemical characteristics， and 16S rDNA sequences were studied. R11 was a gram-negative bacillus with a flagellum on the top. A phylogenetic tree was constructed by comparing with the published 16S rDNA sequences of the related bacteria species. In the phylogenetic tree， the overall similarity value between strain R11 and Serratia sp. was 99%.

Key words： Serratia sp.; 16S rDNA; Pseudomonas solanacarum Smith

中國(guó)生姜資源豐富，廣泛種植于山東、陜西及南方各省市，日本、印度等東南亞國(guó)家以及南非、北美和澳大利亞也有栽培。生姜營(yíng)養(yǎng)成分豐富[1]，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明其具有強(qiáng)心、殺菌、抗炎、抗運(yùn)動(dòng)病等作用[2]，對(duì)消化系統(tǒng)和心血管疾病等都有一定的防治作用[3，4]，還可以抑制體外腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[5]。青枯假單胞桿菌（Pseudomonas solanacarum Smith）作為引起生姜姜瘟病的主要病原菌[6]，易侵入，侵染速度快，嚴(yán)重的可在半月左右造成生姜全田無收[7-9]，已成為制約生姜優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的毀滅性病害之一。

采用篩選抗病品種、施用化學(xué)農(nóng)藥等措施可防治姜瘟病發(fā)生，但是輪作和篩選抗病品種周期長(zhǎng)，使用化學(xué)農(nóng)藥不僅不能從根本上防治病原菌，反而帶來了環(huán)境污染[10]。生物防治可作為有效解決土傳病害的一條有希望的途徑[11]，利用拮抗菌防治姜瘟病無疑具有廣闊的應(yīng)用前景。目前，關(guān)于植物細(xì)菌性青枯病的生物防治，國(guó)內(nèi)外研究工作很多，但針對(duì)姜瘟病的研究則較少[12，13]。冉紅艷等[14]發(fā)現(xiàn)了1株青枯假單胞桿菌的拮抗菌，鏈霉菌菌株BC233;孫彩云等[15] 報(bào)道了10%的木霉菌株SMF2提取物能夠產(chǎn)生直徑達(dá)12 mm的抑菌圈;楊合同等[16]也篩選出能有效地降低青枯病菌的群體數(shù)的芽孢桿菌B1301。另外，歐艷華[17]報(bào)道了1株拮抗菌，為黏質(zhì)沙雷氏菌株。本研究從生姜連作田土中分離篩選得到1株對(duì)青枯假單胞桿菌有強(qiáng)拮抗作用的沙雷氏菌株R11，并從細(xì)菌形態(tài)特征、生理生化特征以及基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育分析對(duì)該菌進(jìn)行了系統(tǒng)鑒定。

1 ? 材料與方法

1.1 ? 材料

1.1.1 ?菌種來源 ?菌株R11系生姜連作地土壤中分離得到。致病菌青枯病病原菌、大腸桿菌DH5α、pGEM-T載體由中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所保存。

1.1.2 ?培養(yǎng)基 ?牛肉膏-蛋白胨培養(yǎng)基，甘油精氨酸培養(yǎng)基，高氏1號(hào)培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基。鑒定用試劑和培養(yǎng)基從海鴻實(shí)驗(yàn)儀器有限公司購(gòu)買。

1.1.3 ?試驗(yàn)試劑 ?分離拮抗菌所用的試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。Taq酶等均購(gòu)自英駿生物公司。PCR引物由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司合成。小量DNA膠回收試劑盒，產(chǎn)自天澤基因公司。

1.2 ? 菌株的分離篩選

從生姜連作地土壤若干，將土樣5 g經(jīng)無菌生理鹽水充分振蕩10 min，制成1∶10（m∶V）土壤懸浮液，靜置沉淀后，取上清梯度稀釋后，涂布平板，28 ℃培養(yǎng)24～120 h。分離得到單菌落接種在涂布有姜瘟病原菌平板上，根據(jù)抑菌圈大小挑選初篩菌株。再將初篩菌株用改良自冉紅艷等[14]的瓊脂打孔法進(jìn)行復(fù)篩，根據(jù)抑菌圈大小篩選出生姜青枯假單胞桿菌的強(qiáng)拮抗菌株。

1.3 ? 形態(tài)特征和培養(yǎng)特征

于牛肉膏-蛋白胨培養(yǎng)基斜面上28 ℃培養(yǎng)24 h后，觀察菌落形態(tài)。在四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心透射電鏡下觀察個(gè)體形態(tài)并測(cè)量菌體大小，觀察有無芽孢、鞭毛及其特征。

1.4 ? 生理生化特征

參照文獻(xiàn)[18，19]對(duì)R11進(jìn)行生理生化鑒定。

1.5 ? 16S rDNA的序列分析

參照文獻(xiàn)[20]提取基因組總DNA，，用primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)了1對(duì)PCR引物Primer A（5′-ATGGATCCGAGAGTTTGATCCTGGTCAG-3′）和Primer B（5′-TATCTGCAGTGGTGTGACGGGCGGTGT-3′）。PCR擴(kuò)增50 uL反應(yīng)體系包括PCR反應(yīng)體系：10×PCR緩沖液5 μL，MgCl2（25 mmol/L）3 μL，dNTP（10 mmol/L）1 μL，引物A/B（20 μmol/L）各1 μL，模板DNA（約50 g/L）3 μL，Taq酶0.5 μL，雙蒸水35.5 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃ 4 min;94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pGEM-T載體連接后，將酶切及PCR鑒定初步正確的重組子送交上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。在序列分析過程中，將測(cè)得的序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)應(yīng)用BLAST程序與數(shù)據(jù)庫(kù)中已有16S rDNA序列進(jìn)行同源性比較分析，序列比較及系統(tǒng)發(fā)育分析采用用MEGA 5的Neighboer-Joining方法[21]。

2 ?結(jié)果

2.1 ?拮抗菌的分離篩選

初步分離出11株對(duì)病原真菌有拮抗作用的放線菌，9株拮抗細(xì)菌（表1）。將這20株菌用打孔法進(jìn)行復(fù)篩，得到產(chǎn)生抑菌圈最大的菌株，即R11（圖1），其抑菌圈直徑接近1.2 cm。

2.2 ? 拮抗菌R11形態(tài)和生化特征

R11在肉湯培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)，該菌株落開始時(shí)出現(xiàn)透明黏稠的菌落，呈圓形，光滑，濕潤(rùn)，表面隆起，邊緣整齊，有輕微異味，培養(yǎng)24 h后菌落呈綠色，色素?cái)U(kuò)散到培養(yǎng)基中。電鏡下R11是短小桿菌，有鞭毛。菌體長(zhǎng)1.190～1.770 μm，寬0.658～0.920 μm，端生一根鞭毛（圖2）。

生化性質(zhì)具體鑒定結(jié)果見表2。所分離到的菌株與沙雷氏菌的生理特性較一致，該菌株為革蘭氏陰性短桿菌，能利用賴氨酸、鳥氨酸、葡萄糖、蔗糖、山梨醇;不能利用精氨酸、乳糖、阿拉伯糖、棉子糖。不產(chǎn)生苯丙氨酸，可產(chǎn)生DNase和脲酶。

2.3 ?16S rDNA的序列分析

2.3.1 ?16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物 ?以R11基因組DNA為模板，引物Primer A 和Primer B為模板擴(kuò)增出了一條長(zhǎng)度約1 400 bp的PCR產(chǎn)物。擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果顯示其長(zhǎng)度為719 bp，其在Genebank中的登陸號(hào)為EU660208。

2.3.2 ?基于16S rDNA序列的聚類結(jié)果 ?根據(jù)R11的16S rDNA序列與GenBank中的序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，與其同源性最高的個(gè)模式菌株為沙雷氏菌。選取10個(gè)模式菌株，用MEGA 5軟件構(gòu)件系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。可以看出R11與2個(gè)沙雷氏菌聚成一支，R11菌株的16S rDNA序列與沙雷氏菌同源性高達(dá)99%。

3 ?討論

姜瘟病對(duì)生姜連作地的影響更為嚴(yán)重，其原因主要跟青枯假單胞桿菌（Pseudomonas solanacarum Smith）的持續(xù)繁殖有關(guān)。好的拮抗菌要能適應(yīng)生姜種植環(huán)境、生存力強(qiáng)、拮抗性顯著、特異性針對(duì)病原菌的特點(diǎn)，因此在發(fā)病率大于90%的生姜連做土壤區(qū)分離到對(duì)青枯假單胞桿菌具有較強(qiáng)拮抗作用菌株20株（表1）。拮抗菌和其他共生菌株不僅爭(zhēng)奪青枯假單胞桿菌生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)、氧氣及空間位置，并對(duì)生長(zhǎng)增殖起抑制作用。R11菌株對(duì)病原菌抑菌圈直徑約1.2 cm，是一種對(duì)青枯假單胞桿菌具有強(qiáng)拮抗作用的菌。拮抗微生物通過分泌1種或多種拮抗物質(zhì)而直接抑制或殺死病原菌[22]。這些拮抗物質(zhì)包括酶類、抗生素、細(xì)菌素或細(xì)菌素類似物，以及缺陷型噬菌體和具有抗菌作用的如氨類、有機(jī)酸、過氧化氫酶等初始代謝途徑中的副產(chǎn)品和其他次生代謝物等[23]。

R11的基本形態(tài)和革蘭氏表型與沙雷氏菌一致。通過電鏡結(jié)果可知，R11是單生鞭毛菌（圖2），而沙雷氏菌屬為周生鞭毛菌，其鞭毛單生性質(zhì)與沙雷氏菌周身鞭毛特性不一致，但宋建華等[24]的研究結(jié)果表明，沙雷氏菌也有單生鞭毛的情況出現(xiàn)。采用GenBank中與之同源性最高的11株細(xì)菌模式株的16S rDNA序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系樹（圖3），其同源性與沙雷氏菌很相近，同源性高達(dá)99%?？梢詫⑥卓咕鶵11最終鑒定為沙雷氏菌（Serratia sp.）。國(guó)內(nèi)鮮有利用沙雷氏菌來拮抗生姜青枯假單胞桿菌的報(bào)道。本研究從生姜田土分離篩選到1株對(duì)生姜青枯假單胞桿菌有很強(qiáng)的抑制作用的沙雷氏菌R11，為姜瘟病的生物防治拓展了空間。有關(guān)菌株的其他特性及拮抗機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

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