清化飲對慢性胃炎脾胃濕熱證胃黏膜蛋白的影響

付肖巖，陳小玲，王 薇，胡光宏，徐從榮，林 平，高尤亮

（福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院，福建 福州350003）

慢性胃炎為臨床常見病、多發(fā)病，病程長，往往纏綿不愈，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。脾胃濕熱證是慢性胃炎常見的實證，有研究顯示399例慢性胃炎中，屬脾胃濕熱證 209 例（占 52.38%）［1］。目前研究顯示中醫(yī)藥對其治療效果顯著高于西藥［2-4］。清化飲是我國名老中醫(yī)楊春波主任醫(yī)師治療慢性胃炎脾胃濕熱證的經(jīng)驗方，具有良好的臨床療效［5］，但清化飲治療慢性胃炎脾胃濕熱證的作用機制目前尚未闡明。本實驗應(yīng)用雙向凝膠電泳技術(shù)研究清化飲對慢性胃炎脾胃濕熱證患者胃黏膜蛋白的影響，以期為清化飲治療慢性胃炎脾胃濕熱證作用機制提供進一步的理論依據(jù)。

1 臨床資料

1.1 病例選擇條件

1.1.1 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照2012年中華醫(yī)學(xué)會消化病學(xué)分會制定的《中國慢性胃炎共識意見》［6］。胃鏡診斷標(biāo)準(zhǔn)：慢性非萎縮性胃炎胃鏡下可見黏膜紅斑，黏膜出血點或斑塊，黏膜粗糙伴或不伴水腫，及充血滲出等基本表現(xiàn)。慢性萎縮性胃炎胃鏡下可見黏膜紅白相間，以白相為主，皺襞變平甚至消失，部分黏膜血管顯露，可伴有黏膜顆?；蚪Y(jié)節(jié)狀等表現(xiàn)。

病理診斷標(biāo)準(zhǔn)：① 慢性炎癥 正常：單個核細(xì)胞每高倍視野不超過5個，如數(shù)量略超過正常而內(nèi)鏡下無明顯異常，病理可診斷為基本正常；輕度：慢性炎癥細(xì)胞較少并局限于黏膜淺層，不超過黏膜層的1／3；中度：慢性炎癥細(xì)胞較密集，不超過黏膜層2／3；重度：慢性炎癥細(xì)胞密集，占據(jù)黏膜全層。②活動性0：慢性炎癥背景上無中性粒細(xì)胞浸潤；+：黏膜固有層有少數(shù)中性粒細(xì)胞浸潤；++：中性粒細(xì)胞較多存在于黏膜層，可見于表面上皮細(xì)胞、小凹上皮細(xì)胞或腺管上皮內(nèi)；+++：中性粒細(xì)胞較密集，或除中度所見外還可見小凹膿腫。③ 萎縮 輕度：固有腺體減少不超過原有腺體的1／3來計算；中度：固有腺體數(shù)減少介于原有腺體的1／3～2／3；重度：固有腺體數(shù)減少超過2／3，僅殘留少數(shù)腺體，甚至完全消失。④ 腸化輕度：腸化區(qū)占腺體和表面上皮總面積1／3以下；中度：腸化區(qū)占腺體和表面上皮總面積1／3～2／3；重度：腸化區(qū)占腺體和表面上皮總面積2／3以上。

1.1.2 脾胃濕熱證辨證標(biāo)準(zhǔn) 參照2011年中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會消化系統(tǒng)疾病專業(yè)委員會制定的《慢性胃炎的中西醫(yī)結(jié)合診療共識意見》［7］，主癥：① 胃脘痞脹或疼痛；②舌質(zhì)紅，苔黃膩或黃厚。次癥：①胃脘灼熱；② 口臭口苦；③ 惡心嘔吐；④ 大便黏滯；⑤脈滑數(shù)或濡數(shù)。判斷：具備主癥2項加次癥1項，或主癥第1項加次癥2項即可診斷。

1.1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)

1.1.3.1 健康對照組 ①年齡大于18歲且小于60歲的健康體檢者；②經(jīng)本院體檢中心檢查排除主要臟器的器質(zhì)性疾病及糖尿病等內(nèi)分泌疾病者；③鏡下黏膜正常，且無上消化道不適癥狀；④ 同一部位（胃竇部）的3塊活檢標(biāo)本病理提示為正常和／或輕度淺表性炎癥者。

1.1.3.2 治療組 ① 年齡大于18歲且小于60歲的患者；② 符合西醫(yī)慢性胃炎診斷標(biāo)準(zhǔn)者；③ 符合中醫(yī)脾胃濕熱證辨證標(biāo)準(zhǔn)者。

1.1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) ①18歲以下或60歲以上患者，妊娠或哺乳期婦女；② 合并心血管、腦血管、肝腎和造血系統(tǒng)等嚴(yán)重原發(fā)性疾病，精神病患者；③ 實驗前2周服用過抑酸藥物、糖皮質(zhì)激素、非甾體類抗炎藥和抗生素者。

1.2 一般資料 30例患者均來源于我院2013年2月—2013年12月消化內(nèi)科門診及病房。其中男15例，女 15例；年齡 30～57歲，平均年齡（38±8.26）歲；病程1個月～8 a。同時按照簡單隨機抽取方法選取我院2013年2月—2013年12月健康體檢者30例作為健康對照組。其中男17例，女13例；年齡28～59 歲，平均年齡（40±7.15）歲。

2 材料與方法

2.1 材料 清化飲由綿茵陳、薏苡仁、厚樸、生扁豆、黃連、赤芍、白豆蔻、佩蘭等組成（我院院內(nèi)制劑，500 mL／瓶，生產(chǎn)批號：130210）；固相 pH 梯度干膠條（24 cm，pH 3～10）、兩性電解質(zhì)（pH 3～10）、蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒均購自北京中原合聚經(jīng)貿(mào)有限公司；等電聚焦儀PROTEAN IEF Cell、電泳儀 Power／PAC 3000、PROTEAN DodecaCell 垂 直 電 泳 儀 、GS710掃描儀 （Bio-Rad）、PDQuest 8.0軟件均購自biorad公司。

2.2 治療方法 治療組服用清化飲，每次20 mL，每日3次，餐前半小時口服，療程共1個月。

2.3 標(biāo)本采集及保存 健康對照組、治療組胃黏膜組織標(biāo)本均在我院胃鏡室收集，每個標(biāo)本取5塊（胃竇2塊取自距幽門2～3 cm處的大彎和小彎；胃體2塊取自距賁門8 cm處的大彎和小彎；胃角1塊，約距胃角近側(cè)4 cm）。活檢樣本用生理鹽水反復(fù)沖洗以去除血液等污染后，在30 min內(nèi)保存于標(biāo)記好的凍存管中-80℃冰箱保存。

2.4 胃黏膜總蛋白的提取 ① 用液氮預(yù)冷的砸碎器將組織砸碎，再用液氮將砸碎的粉末研磨，加入Cocktail蛋白酶抑制劑。②將一部分lysis加入樣品粉末中，將其溶解，再轉(zhuǎn)入Dounce勻漿器中，上下勻漿10次。③將樣品放入燒杯里超聲，超聲杯必須裝有冰水混合物，按照21%振幅進行超聲。④在冰上提取，時間為 30 min。 ⑤ 離心（14000 g×1 h），棄沉淀取上清。

2.5 雙向凝膠電泳 用雙向凝膠電泳（2-DE）方法進行蛋白質(zhì)分離，利用考馬斯亮藍(lán)染色方法［8］進行電泳凝膠染色。

2.6 凝膠圖像采集及分析 銀染后的雙向凝膠應(yīng)用GS710掃描儀進行掃描，圖像分析使用PDquest 8.0軟件。分析包括蛋白質(zhì)斑點的檢測、量化、背景去除和點的匹配。

3 治療結(jié)果

3.1 療效判斷標(biāo)準(zhǔn) 參照2011年中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會消化系統(tǒng)疾病專業(yè)委員會制定的《慢性胃炎的中西醫(yī)結(jié)合診療共識意見》［7］。胃鏡及病理療效判定標(biāo)準(zhǔn)：①治愈：胃鏡復(fù)查活動性炎癥消失，慢性炎癥好轉(zhuǎn)達輕度，腺體萎縮、腸化生和異型增生消失；②顯效：黏膜急性炎癥基本消失，慢性炎癥好轉(zhuǎn)，腺體萎縮、腸化生和異型增生明顯減輕；③ 有效：黏膜病變范圍縮小1／2以上，炎癥有所減輕，腺體萎縮、腸化生和異型增生減輕；④ 無效：內(nèi)鏡及病理所見均無好轉(zhuǎn)者。中醫(yī)證候療效判定標(biāo)準(zhǔn)：①臨床痊愈：主要癥狀、體征消失或基本消失，療效指數(shù)≥95%；②顯效：主要癥狀、體征明顯改善，70%≤療效指數(shù)＜95%；③ 有效：主要癥狀、體征明顯好轉(zhuǎn)，30%≤療效指數(shù)＜70%；④ 無效：主要癥狀、體征無明顯改善，甚或加重，療效指數(shù)＜30%。

療效指數(shù)＝［（治療前積分－治療后積分）／治療前積分］×100%。

所有癥狀均分為無、輕、中、重4級，主癥分別記以 0、2、4、6 分，次癥分別記以 0、1、2、3 分。

3.2 治療組療效 ① 中醫(yī)證候療效：治愈率為3.33%，顯效率為33.33%，有效率為60%，總有效率96.67%。② 胃鏡下療效：治愈率為10%，顯效率為30%，有效率為53.33%，總有效率93.33%。③ 病理療效：治愈率為0%，顯效率為26.67%，有效率為53.33%，總有效率80%。

3.3 實驗結(jié)果 在相同條件下分別對各組胃黏膜總蛋白進行雙向凝膠電泳分離，考馬斯亮藍(lán)染色后獲得各組的2-DE圖譜，見圖1。再經(jīng)GS710掃描儀掃描后，經(jīng)PDQuest8.0圖像分析軟件分析，每塊雙向凝膠可分離近600個左右蛋白質(zhì)點。3次雙向凝膠電泳圖譜有極大相似形，在相同的設(shè)定值下獲得了健康對照組、治療組治療前、治療后胃黏膜蛋白質(zhì)點數(shù)依次為（510±22）個、（527±49）個、（526±30）個。經(jīng)圖像分析統(tǒng)計后發(fā)現(xiàn)：治療組與健康對照組比較有21個蛋白表達上調(diào)，10個蛋白表達下調(diào)；治療組治療前后比較，表達上調(diào)21個蛋白質(zhì)中有18個表達降低，而表達下調(diào)10個蛋白質(zhì)中有9個表達增強。各差異蛋白質(zhì)點見表1。

4 討 論

清化飲作為治療慢性胃炎脾胃濕熱證的一個代表方，具有良好的臨床療效，然而目前對于清化飲的研究只停留在藥效觀察水平，國內(nèi)外均未見清化飲對慢性胃炎脾胃濕熱證患者胃黏膜蛋白影響的文獻報道。差異蛋白質(zhì)組學(xué)是針對動態(tài)變化著的蛋白質(zhì)組的整體來進行比較，分析不同蛋白質(zhì)組表達上的差異，可以發(fā)現(xiàn)與疾病相關(guān)的特異蛋白質(zhì)，而這些特異蛋白質(zhì)不僅可作為疾病診斷及治療的標(biāo)志物，還可為疾病的致病機制提供線索［9-10］。故本實驗應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法，研究清化飲對慢性胃炎脾胃濕熱證胃黏膜蛋白的影響。

圖1 3組胃黏膜2-DE圖譜

表13組有明顯差異的蛋白質(zhì)點

清化飲方中綿茵陳性苦微寒，以其善能清熱利濕，又因其長于三月獨得春升之氣，故入肝經(jīng)兼能上行，為君藥；薏苡仁利水滲濕而健脾；生扁豆味甘性微溫，能醒脾化濕；白豆蔻化濕行氣，溫中止嘔；佩蘭能化濕解暑；輔以苦寒之黃連清熱燥濕；配以辛溫之厚樸化濕理氣除滿；佐以赤芍以清熱涼血，散瘀止痛。全方藥性平和，藥味精，藥量輕，寒溫并用，共奏清熱化濕、理氣活血之功。本研究從中醫(yī)證候療效、胃鏡下療效、病理療效等多方面觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)清化飲能有效減輕臨床癥狀，改善慢性胃炎脾胃濕熱證患者胃鏡下及病理表現(xiàn)。因此，清化飲治療慢性胃炎脾胃濕熱證有良好的臨床療效。

蛋白質(zhì)組學(xué)研究之所以能迅速發(fā)展，要歸功于雙向凝膠電泳技術(shù)的創(chuàng)立和不斷完善，它是分離組織細(xì)胞蛋白質(zhì)組分的核心技術(shù)［11］。所以，建立圖像清晰、分辨率高和重復(fù)性好的2-DE圖譜是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的關(guān)鍵。因此，本實驗對胃黏膜標(biāo)本的采集、總蛋白的提取、2-DE的上樣量進行了多次的摸索，在樣品、雙向凝膠的制備及考馬斯亮藍(lán)染色等過程中盡量保持其統(tǒng)一性，獲得了圖像清晰、分辨率高和重復(fù)性好的胃黏膜蛋白的2-DE圖譜。經(jīng)圖像分析統(tǒng)計后發(fā)現(xiàn)：慢性胃炎脾胃濕熱證患者與正常人比較有21個蛋白表達上調(diào)，10個蛋白表達下調(diào)，表明胃黏膜蛋白質(zhì)表達異?？梢宰鳛槁晕秆灼⑽笣駸嶙C的臨床診斷標(biāo)志物之一；慢性胃炎脾胃濕熱證清化飲治療前后比較，表達上調(diào)21個蛋白質(zhì)中有18個表達降低，而表達下調(diào)10個蛋白質(zhì)中有9個表達增強，表明清化飲治療慢性胃炎脾胃濕熱證可能是通過調(diào)節(jié)胃黏膜蛋白的表達而實現(xiàn)。具體是什么蛋白質(zhì)起作用，有待進一步進行質(zhì)譜分析。

中醫(yī)證候具有整體性、動態(tài)性和異病同證、同病異證等特征，建立能反映證候本質(zhì)并能區(qū)別他證的定性、定量、定位綜合實驗指標(biāo)具有重要的臨床意義［12］。從蛋白質(zhì)水平探討中醫(yī)辨證論證的實質(zhì)，將進一步提高中醫(yī)對疾病規(guī)律的認(rèn)識和治療水平，有助于疾病的早期診斷和治療。

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