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    反轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的P27kip1促HepG2細胞凋亡

    2014-12-07 08:05:14潘永平邱夢標樊曉慧毛紅霞熊水印粟慶娟
    基礎(chǔ)醫(yī)學與臨床 2014年2期
    關(guān)鍵詞:細胞周期培養(yǎng)液質(zhì)粒

    潘永平,龔 輝,邱夢標,樊曉慧,毛紅霞,熊水印,粟慶娟

    (南昌大學第四附屬醫(yī)院感染科,江西南昌330003)

    肝細胞癌是人類最常見的惡性腫瘤之一,癌細胞的生物學特征是多種原癌基因的激活、抑癌基因的失活及一系列復(fù)雜的調(diào)控機制失常所致的生長失控。其主要分子機制是細胞周期紊亂和凋亡過少。P27kip1是一種細胞周期素依賴性激酶抑制劑,可將細胞阻滯于G1期,并誘導(dǎo)細胞凋亡,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)P27kip1在多種腫瘤組織中表達量降低[1],且在腫瘤細胞中,P27kip1減少的程度與細胞DNA損傷的程度有一定的關(guān)系[2]。因此,P27kip1途徑可能成為腫瘤診斷[3]和治療的新的靶點。

    為了研究肝癌細胞中的P27kip1的表達情況,并考查外源導(dǎo)入P27kip1對肝癌細胞的影響,為基于P27kip1的腫瘤治療研究提供理論依據(jù),本實驗構(gòu)建了載有P27kip1基因的反轉(zhuǎn)錄病毒載體,篩選出了可穩(wěn)定產(chǎn)生病毒的PA317包裝細胞,構(gòu)建了過表達P27kip1的 HepG2細胞,并檢測了過表達 P27kip1對HepG2細胞的影響。

    1 材料與方法

    1.1 主要材料

    pLNCX質(zhì)粒、攜帶有人 P27kip1基因的 pUC18-P27質(zhì)粒、DH5α菌種、PA317細胞、HepG2細胞由本實驗室提供。質(zhì)粒提取試劑盒(上海生工生物工程有限公司)。HindⅢ、ClaⅠ限制性內(nèi)切酶、Taq酶(Promega公司),DMEM、FCS、胰蛋白酶、Lipofectamine-2000轉(zhuǎn)染試劑盒、G418(Gibco公司)。鼠抗人P27kip1抗體(Santa Cruz公司)。

    1.2 構(gòu)建p LNCX-P27質(zhì)粒

    分別用HindⅢ及ClaⅠ酶切pUC18-P27質(zhì)粒及pLNCX質(zhì)粒,用T4連接酶將兩者定向連接,轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細菌,提取 pLNCX-p27質(zhì)粒,經(jīng)HindⅢ及ClaⅠ雙酶切鑒定。

    1.3 轉(zhuǎn)染PA317細胞

    采用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將15μL的重組pLNCX-p27質(zhì)粒轉(zhuǎn)染反轉(zhuǎn)錄病毒包裝細胞 PA317,同時以空pLNCX載體作為對照組。轉(zhuǎn)染48 h后,胰蛋白酶消化細胞,培養(yǎng)液中加入300μg/L G418進行篩選,每3~4 d換液1次,G418濃度逐漸增加至500μg/L,3周后獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染克隆。對穩(wěn)定克隆擴大培養(yǎng),部分凍存,部分繼續(xù)在50 mL培養(yǎng)瓶中培養(yǎng),細胞鋪滿后按1∶3的比例傳代,并更換不含G418的培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h,收集上清液,離心、0.22μm濾膜過濾后-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.4 測定病毒滴度

    檢測前24 h傳代 HepG2細胞,細胞生長達60%~70%匯合度時,取保存的病毒上清液加入無血清DMEM培養(yǎng)液,并以102、103和104倍稀釋,稀釋液分別加入HepG2細胞中,2.5 h后加入含有500μg/L G418及10%FCS的 DMEM培養(yǎng)液,每3~4 d換液1次,維持G418濃度不變,3周后計數(shù)抗性克隆數(shù)。病毒滴度=平均抗性克隆數(shù)×病毒液稀釋倍數(shù)。

    1.5 感染HepG2細胞

    HepG2細胞以5×105個接種于250 mL培養(yǎng)瓶中,于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng),待細胞鋪滿瓶底約70%時,加入pLNCX-P27病毒懸液,另設(shè)對照組加入pLNCX空載體病毒液;同時加入聚凝胺至終濃度6 mg/L,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后按1∶5傳代,24 h后加入G418至終濃度500 mg/L進行篩選,3周后對陽性細胞進行克隆化培養(yǎng),建立HepG2-P27細胞系及對照組HepG2-pLNCX細胞系。

    1.6 Western blot檢測

    裂解液破裂細胞,離心后取上清,檢測總蛋白濃度,取50μg蛋白進行12%SDS-PAGE電泳,電泳之后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上,加一抗于37℃孵育30 min,洗滌后加入辣根過氧化物酶標記的二抗于37℃孵育30 min,化學發(fā)光法顯色拍照。

    1.7 MTT

    取生長狀態(tài)良好的對數(shù)增殖期的細胞,設(shè)HepG2-P27細胞組、HepG2-pLNCX對照組和HepG2細胞空白對照組,每組24個復(fù)孔,常規(guī)消化記數(shù)后,用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度至3×107按200μL每孔接種于96孔板,于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng),每3天換1次液。每24 h各取3個復(fù)孔進行檢測,連續(xù)8 d。檢測前4 h每孔加入MTT 20μL/孔,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去培養(yǎng)液,加入二甲基亞砜100μL/孔,振蕩15 min后,用酶標儀于490 nm波長下檢測A490nm值。

    1.8 流式細胞術(shù)檢測細胞周期及細胞凋亡

    HepG2-p27細胞及常規(guī)HepG2細胞各設(shè)置3個復(fù)孔,胰蛋白酶消化后收集細胞,用 PBS制成2×108/L的單細胞懸液,用FCM流式細胞儀進行PI單色熒光細胞流式計數(shù),觀察G1期、S期和G2期細胞所占百分數(shù)。用Annexin V/PI雙染色法檢測細胞凋亡情況。

    2 結(jié)果

    2.1 反轉(zhuǎn)錄病毒載體p LNCX-P27的構(gòu)建

    構(gòu)建的含有 P27kip1基因的反轉(zhuǎn)錄病毒載體pLNCX-P27,經(jīng)HindⅢ、ClaⅠ酶切,可出現(xiàn)594 bp的條帶(圖1),證明目的基因插入正確,載體構(gòu)建成功。

    2.2 病毒滴度檢測

    收集包裝細胞產(chǎn)生的病毒液,計算pLNCX-P27病毒液滴度為2.9×104CfU/mL,對照組pLNCX空載體病毒液滴度為3.2×104CfU/mL。

    2.3 Western blot結(jié)果

    HepG2-P27組細胞中可高表達P27kip1蛋白,而空載體病毒及HepG2空白對照組中僅有微量P27kip1蛋白表達(圖2),證明構(gòu)建的反轉(zhuǎn)錄病毒pLNCX-P27可將P27kip1基因?qū)爰毎⒃诩毎麅?nèi)高表達。

    圖1 p LNCX-P27質(zhì)粒HindⅢ/ClaⅠ雙酶切鑒定Fig 1 pLNCX-P27 vector digested by HindⅢand ClaⅠ

    圖2 P27kip1在HepG2中的表達Fig 2 Expression of P27kip1 in HepG2

    2.4 P27kip1對Hep G2細胞形態(tài)的影響

    正常HepG2細胞生長旺盛,鏡下可見較多分裂相,細胞倍增快;而實驗組細胞與對照組相比,增生效慢,且出現(xiàn)較多凋亡細胞:細胞體積明顯縮小,胞核固縮,胞質(zhì)中有空泡形成(圖3)。

    2.5 P27kip1對Hep G2生長速度的影響

    與pLNCX空質(zhì)粒組相比,pLNCX-P27組可明顯抑制HepG2細胞的增長(p<0.01),而pLNCX組與HepG2空白對照組無差異(圖4)。

    2.6 P27kip1對Hep G2細胞周期的影響

    導(dǎo)入P27kip1基因的HepG2-P27組處于G1期的細胞明顯高于對照組(p<0.01),而處于S期的細胞顯著減少(p<0.01)(圖5)。

    圖3 P27kip1對HepG2生長形態(tài)的影響Fig 3 Effect of P27kip1 on Hep G2 morphology(×100)

    圖4 P27kip1對HepG2生長速度的影響Fig 4 Effect of P27kip1 on HepG2 growth

    圖5 P27kip1對Hep G2細胞周期的影響Fig 5 Effect of P27kip1 on the cell cycle of Hep G2

    圖6 P27kip1對Hep G2細胞凋亡的影響Fig 6 Effect of P27kip1 on apoptosis of Hep G2

    2.7 P27kip1對HepG2細胞凋亡的影響

    HepG2空白對照組、HepG2-pLNCX對照組與HepG2-P27三組細胞的凋亡比率依次為(6.32±1.16)%,(6.90±0.93)%和(27.85±4.42)%,空白對照組與空質(zhì)粒對照組之間無統(tǒng)計學差別,導(dǎo)入P27kip1基因的 HepG2-P27組則明顯高于對照組(p<0.01)(圖6)。

    3 討論

    腫瘤細胞的永生化和分裂失控是腫瘤細胞惡性增生的根本原因,而細胞周期調(diào)節(jié)蛋白在正常細胞的生長和腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。真核細胞的細胞周期由一系列的細胞周期素(cyclins)和細胞周期素依賴性激酶(cyclin dependent kinases,CDKs)的有序激活和失活調(diào)控,而細胞周期素依賴性激酶抑制劑(cyclin-dependent-kinase inhibitors,CKIs)是細胞周期負性調(diào)控因子[4]。P27kip1是 CKIs的主要成分之一,主要抑制細胞周期蛋白E-CDK2和細胞周期蛋白D-CDK4等G1期激酶復(fù)合物,使細胞不能通過G1期,并誘導(dǎo)細胞凋亡。人為地減少P27蛋白的表達,可使正常細胞出現(xiàn)惡性傾向[5],而增加其表達則可使某些腫瘤細胞惡性表現(xiàn)逆轉(zhuǎn)。

    本實驗構(gòu)建了含人P27kip1的重組反轉(zhuǎn)錄病毒載體,導(dǎo)入 PA317細胞,篩選出了穩(wěn)定產(chǎn)生病毒的PA317-P27細胞,并用病毒成功感染HepG2細胞,經(jīng)克隆化培養(yǎng),成功建立了過表達P27kip1的肝癌細胞模型,并證實過表達的P27kip1將細胞阻滯于G1期,并通過誘導(dǎo)細胞凋亡等機制抑制 HepG2的生長。

    [1]Rohlfing AK,Trescher K,Hahnel J,et al.Partial hepatectomy in rats results in immediate down-regulation of P27kip1in residual liver tissue by transcriptional and post-translational processes[J].Front Physiol,2013,4:139 -148.

    [2]Ranchal I,Gonzalez R,Bello RI,et al.The reduction of cell death and proliferation by p27(Kip1)minimizes DNA damage in an experimental model of genotoxicity[J].Int JCancer,2009,125:2270-2280.

    [3]Abdou A,Kandil M,El-Wahed MA,et al.The diagnostic value of p27 in comparison to p57 in differentiation between different gestational trophoblastic diseases[J].Fetal Pediatr Pathol,2013,32:162-164.

    [4] Belletti B,Baldassarre G.New light on p27(kip1)in breast cancer[J].Cell Cycle,2012,11:3701-3702.

    [5]Maass JC,Berndt FA,Canovas J,et al.P27kip1knockdown induces proliferation in the organ of corti in culture after efficient shRNA lentiviral transduction[J].JAssoc Res Otolaryngol,2013,14:295-299.

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