甘草總黃酮抑制慢性萎縮性胃炎大鼠胃黏膜腺體萎縮及機(jī)制研究

鄭 君，林曉春，陳育堯，白殊同，佟 麗

(南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，廣東廣州 510515)

慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic costritis，CAG)是一種由多種因素引發(fā)的、以胃黏膜腺體萎縮為特征的臨床常見消化系統(tǒng)疾病，發(fā)病率占全部慢性胃炎的10%～20%。研究表明CAG具有2.55%～7.46%的癌變率，世界衛(wèi)生組織(WHO)已將慢性萎縮性胃炎定義為癌前狀態(tài)［1－2］。因此，對慢性萎縮性胃炎的積極治療，阻斷向胃癌發(fā)展具有重要的臨床意義。迄今為止，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對CAG尚無特異性治療藥物，臨床上常采用促上皮細(xì)胞生長和促胃腸蠕動藥物以根除幽門螺桿菌感染;補(bǔ)充鐵和維生素B12等方法治療CAG，但均無法從根本上逆轉(zhuǎn)胃黏膜的萎縮及由此引發(fā)的胃功能損傷。中醫(yī)藥在治療難治性疾病上以其獨(dú)特治療方法取得明顯的臨床療效，中醫(yī)將CAG歸為胃脘痛、呃逆、痞滿等范疇，以益氣健脾、活血化瘀、疏肝理氣、清熱解毒藥物治療取得較好的臨床效果。因此，從臨床治療CAG有效中藥及天然藥物中尋找和發(fā)現(xiàn)有效的活性成分，是研制抗CAG藥物的有效途徑之一。

甘草為豆科類植物甘草(Glycyrrhiza uralensisFisch)的根及根狀莖，具有補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、緩急止痛等功效，其活性成分甘草總黃酮具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛等多種作用［3］。我們前期研究證明甘草總黃酮對慢性淺表性胃炎大鼠胃黏膜損傷有明顯的保護(hù)和修復(fù)作用［4］;同時，抑制淺表性胃炎大鼠血清促炎因子的釋放，有明顯抗炎鎮(zhèn)痛作用［5］。甘草總黃酮對慢性萎縮性胃炎是否也有保護(hù)和修復(fù)作用尚未見報(bào)道。本研究采用萎縮性胃炎大鼠模型，評價(jià)甘草總黃酮對CAG大鼠胃黏膜損傷的保護(hù)和修復(fù)作用，并研究其相關(guān)作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動物 SD(Sprague-Dawley)大鼠，體質(zhì)量(200±20)g，SPF級，♂♀各半，6周齡，實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量合格證號0095570，實(shí)驗(yàn)設(shè)施合格證號0051356，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.2 藥物與試劑 甘草總黃酮，購自惠州市九惠制藥股份有限公司(101110);維酶素片，北海陽光藥業(yè)有限公司(101120);大鼠胃泌素(GAS)試劑盒，Bio-swamp公司(201110);胃蛋白酶測試盒，南京建成生物工程研究所(20120224);牛膽汁提取去氧膽酸鈉(進(jìn)口分裝)，美國Amresco公司(0613);水合氯醛，天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心(20040220);大鼠白介素-1 beta(IL-1β)試劑盒，Dakewe公司(E3012-1203-1);大鼠白介素-6(IL-6)試劑盒，Biolegend公司(B150707);PBS緩沖液試劑包，博士德生物工程有限公司(AR0030)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 iMARK酶標(biāo)儀，美國Bio-Rad公司;752N紫外分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器有限公司;BA 110S萬分之一電子天平，Sartorius公司;YP10002電子稱，上海佑科儀器儀表有限公司;EG 1160組織病理包埋儀，RM 2135組織病理切片機(jī)，德國Leica公司;HC3018R高速冷凍離心機(jī)，安徽中科科學(xué)儀器有限公司;TDL-40B低速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠;ECLIPSE Ti-S電子顯微鏡，日本Nikon公司;BH-2光學(xué)顯微鏡，日本Olympus公司。

2 方法

2.1 大鼠慢性萎縮性胃炎模型制備、分組及給藥［6－7］SPF級SD大鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，剔除不合格動物，隨機(jī)分為正常對照組、模型組。模型組大鼠自由飲用20 mmol·L－1去氧膽酸鈉溶液(去離子水配制，pH 7～7.8)1個月，每隔10 d灌服1次60%乙醇2 ml/只;從d 30起分別給予30%乙醇及10 mmol·L－1去氧膽酸鈉溶液自由飲用，每7 d輪換1次，在造模后d 80、d 100隨機(jī)抽取模型組大鼠，進(jìn)行胃組織病理學(xué)檢測，判定模型復(fù)制情況。造模100 d后，將模型動物隨機(jī)分為模型對照組、維酶素組、甘草總黃酮高(0.60 g·kg－1)、低(0.15 g·kg－1)劑量組，并與正常對照組同時納入實(shí)驗(yàn)，每組12只。

2.2 胃黏膜組織病理學(xué)檢查［8］胃組織10%甲醛溶液固定，取胃組織進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色，以慢性炎癥程度(單核細(xì)胞浸潤)、炎癥活動性程度(中性粒細(xì)胞浸潤)以及萎縮性程度(黏膜固有層固有腺體的減少)作為評分指標(biāo)，每項(xiàng)分為正常(－)、輕度(+)、中度(■)、重度(■)(對應(yīng) 0、1、2、3分，有其余炎性表現(xiàn)加1分)，最終以幽門部和胃體部兩者得分和為病理學(xué)炎性評分結(jié)果，正常:0分;輕度:1～4分;中度:5～8分;重度:9分以上。2.3 胃液分泌量及胃蛋白酶活性測定 大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)麻醉后仰位姿勢，墊高頭部使其高于胃位置，幽門下0.3 cm處結(jié)扎。5 h后，剪開結(jié)扎處10 ml離心管收集5 h胃液，4 000 r·min－1，15 min 后，吸取上清液測量體積并轉(zhuǎn)入 2.0 ml EP 管，13 000 r·min－1，10 min，取上清按試劑盒說明書測定胃蛋白酶活性。

2.4 血清中GAS、IL-1β、IL-6含量測定 大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)麻醉后，腹主動脈采血，3 500 r·min－1離心 15 min，按試劑盒說明書操作方法測定血清GAS、IL-1β、IL-6含量。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以±s表示，計(jì)量資料采用單因素方差分析;組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 胃黏膜層組織病理學(xué)變化 正常對照組胃黏膜腺管排列整齊，大小形狀一致，呈單柱狀，壁細(xì)胞、主細(xì)胞界限清楚，固有層內(nèi)胃腺體排列緊密整齊，未見或少見炎性細(xì)胞，黏膜下層無水腫(Fig 1A)。模型組胃黏膜充血、水腫、腺管排列紊亂或疏密不均且黏液層脫落增多、胃小凹變淺，同時黏膜固有層變薄，黏膜肌層紊亂、增厚，呈束狀增生滲入黏膜固有層，腺體腔變小及數(shù)目減少，并有囊性擴(kuò)張，黏膜下層水腫明顯，炎性細(xì)胞散在分布，固有層內(nèi)有淋巴細(xì)胞浸潤，有少量嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，胃黏膜下層擴(kuò)張合并下緣缺損，炎細(xì)胞多見且向黏膜固有層遷移(Fig 1B)。甘草總黃酮給藥30 d后，胃黏膜固有層固有層炎性細(xì)胞數(shù)目減少，固有胃腺數(shù)目增多，腺管排列稍平整(Fig 1D，E)。與模型組比較，甘草總黃酮高、低劑量組明顯抑制胃黏膜腺體萎縮;另外高、低劑量組等級分布下降，胃組織病理學(xué)檢查評分明顯減少(Fig 1、Tab 1、Fig 2)

Fig 1 Histopathology of the gastric mucosa in different groups(HE staining ×100)

Tab 1 Mucosal atrophy rat of the rats in different groups(n=12，%)

3.2 各組大鼠胃液分泌量以及胃蛋白酶活性分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常對照組比較，模型組胃液分泌量以及胃蛋白酶活性明顯降低(P＜0.01);甘草總黃酮給藥30 d后，甘草總黃酮高、低劑量組與模型對照組比較胃液分泌量及胃蛋白酶活性明顯升高(P＜0.05，F(xiàn)ig 3，4)

Fig 2 Histopathology scores in different groups

Fig 3 Effect of different treatment on Gastric juice secretion in rats

Fig 4 Effect of different treatment on the activity of pepsin in rats

3.3 對血清中GAS、IL-1β、IL-6含量的影響 與正常對照組比較，模型組血清GAS、IL-1β、IL-6含量明顯上升。甘草總黃酮高、低劑量組給藥30 d后，血清GAS、IL-1β、IL-6水平與模型組比較明顯降低(Fig 5)

4 討論

Fig 5 Effect of different treatment on serumGAS，IL-1β，IL-6 lever in rats

慢性萎縮性胃炎是一種由多種原因引起的，以胃黏膜萎縮為主要病理表現(xiàn)的胃黏膜慢性炎癥性病變［9］。本研究采用多因素復(fù)合方法，成功復(fù)制了大鼠慢性萎縮性胃炎模型，甘草總黃酮給藥30 d后，高、低劑量組胃黏膜萎縮率明顯下降，炎性細(xì)胞數(shù)目明顯減少，提示甘草總黃酮對胃黏膜上皮細(xì)胞具有較好的修復(fù)作用。

大量研究顯示，胃黏膜層存在多種分泌腺體，這些分泌腺體所分泌的胃液對胃起著非常重要的保護(hù)作用。慢性萎縮性胃炎患者由于胃黏膜腺體發(fā)生不同程度的萎縮，因此其胃液分泌量明顯減少，胃液酸性減弱，對胃蛋白酶活性的保持作用也受到影響，使胃蛋白酶活性明顯下降，而胃蛋白酶是胃液中的主要消化酶，其活性與胃液的酸性直接相關(guān)［10］。胃泌素是一種由胃以及十二指腸G細(xì)胞分泌的多肽類激素，胃液中胃泌素的主要功能是促進(jìn)胃酸分泌，同時還對胃腸道黏膜具有營養(yǎng)和保護(hù)作用，從而能夠加快胃腸道黏膜的生長和更新速度，在慢性萎縮性胃炎中由于胃黏膜上皮細(xì)胞的萎縮，導(dǎo)致G細(xì)胞數(shù)量的下降，從而使GAS分泌減少，GAS的減少使胃黏膜失去了激素的營養(yǎng)作用，又使胃黏膜進(jìn)一步的萎縮，形成惡性循環(huán)［11－12］。本研究結(jié)果顯示，慢性萎縮性胃炎模型對照組胃液分泌量、胃蛋白酶活性以及血清GAS含量較空白對照明顯降低，說明胃液以及GAS分泌不足，胃蛋白酶活性降低，從而導(dǎo)致的胃液低酸狀態(tài)與胃黏膜萎縮直接相關(guān)。經(jīng)甘草總黃酮治療30 d后，其高、低劑量組能夠明顯促進(jìn)胃液以及GAS的分泌，增加胃蛋白酶活性，改善胃黏膜的營養(yǎng)作用，加快胃黏膜上皮細(xì)胞的更新速度，從而促進(jìn)胃黏膜的修復(fù)。

促炎因子IL-1β、IL-6的分泌在慢性萎縮性胃炎的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。IL-1β作為一種炎性活性細(xì)胞素，其通過刺激多種免疫和炎癥細(xì)胞，促進(jìn)其他炎癥因子的釋放，從而增強(qiáng)炎癥反應(yīng)［13］。同時IL-1β也是目前最強(qiáng)的胃酸分泌抑制因子，相關(guān)研究證明，IL-1β的高表達(dá)能夠抑制胃酸的分泌，持續(xù)的低胃酸分泌能夠使胃黏膜萎縮，甚至發(fā)生腸化生和異型增生。IL-6是胃黏膜炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)，廣泛參與炎癥反應(yīng)，其可以誘導(dǎo)以中性粒細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞的聚集，造成粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)，形成活性氧，造成組織炎癥，同時這些活化的中性粒細(xì)胞又能分泌IL-1β、IL-6等細(xì)胞因子。IL-6還能通過促進(jìn)一氧化氮合酶的表達(dá)，產(chǎn)生超氧負(fù)離子和一氧化氮，參與胃黏膜的炎癥反應(yīng)［14－17］。本研究結(jié)果顯示，模型對照組IL-1β、IL-6較正常對照組明顯升高，而甘草總黃酮高、低劑量組均能夠明顯下調(diào)IL-1β、IL-6水平，提示甘草總黃酮通過降低IL-1β、IL-6分泌水平，改善胃黏膜的炎癥反應(yīng)程度。

綜上所述，甘草總黃酮對于慢性萎縮性胃炎的治療作用可能是通過調(diào)節(jié)胃液、胃蛋白酶活性、血清GAS、IL-1β以及IL-6的水平，改善胃黏膜的炎癥反應(yīng)以及增加胃黏膜的防御機(jī)能，促進(jìn)胃黏膜上皮細(xì)胞的更新和修復(fù)，進(jìn)而對慢性萎縮性胃炎進(jìn)行修復(fù)。

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