右美托咪定預(yù)防嗎啡耐受及其對(duì)脊髓內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞和ERK的影響

周 寧，陳春龍，高 珊，高獻(xiàn)忠，劉清珍，劉 健，嵇 晴，李偉彥

(1.徐州醫(yī)學(xué)院麻醉學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇徐州 221002;2.南京軍區(qū)南京總醫(yī)院麻醉科，江蘇南京 210002)

嗎啡和其他阿片類鎮(zhèn)痛藥因其耐受和依賴等副作用而嚴(yán)重影響了其在臨床上的使用。近來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，脊髓膠質(zhì)細(xì)胞的活化在嗎啡耐受的發(fā)生和維持中發(fā)揮重要作用［1－3］。強(qiáng)效、高選擇性的α2受體激動(dòng)劑右美托咪定(dexmedetomidine，DEX)在急性炎性痛、術(shù)后痛乃至神經(jīng)病理性疼痛中都具有一定的鎮(zhèn)痛作用，且有研究發(fā)現(xiàn)它能明顯抑制坐骨神經(jīng)結(jié)扎大鼠脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞的肥大和ERK信號(hào)通路的活化［4］，但其對(duì)嗎啡耐受的影響尚不清楚。本研究觀察預(yù)先給予右美托咪定對(duì)正常大鼠嗎啡耐受的作用及其對(duì)脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞活化和ERK磷酸化的影響，探討右美托咪定在多模式鎮(zhèn)痛及防治阿片耐受中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與分組 ♂ SD大鼠48只(南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科提供)，體質(zhì)量180～220 g，隨機(jī)分成6組，每組8只。Ⅰ組空白對(duì)照組;Ⅱ組嗎啡(批號(hào):120714-2，東北制藥集團(tuán)沈陽(yáng)第一制藥有限公司)耐受組;Ⅲ組 50 μg·kg－1右美托咪定對(duì)照組;Ⅳ 組 12.5 μg· kg－1右 美 托 咪 定 (批 號(hào):12100534，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)處理組;Ⅴ組 25 μg·kg－1右美托咪定處理組;Ⅵ組 50 μg·kg－1右美托咪定處理組。

1.2 給藥方案 參照Raghavendra等［2］方法建立嗎啡耐受模型，即每天8∶00和17∶00皮下注射嗎啡10 mg·kg－1，連續(xù)5 d;Ⅰ組和Ⅲ組皮下分別注射等量生理鹽水和右美托咪定;Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組在早上注射嗎啡前30 min皮下注射相應(yīng)劑量的右美托咪定。

1.3 行為學(xué)測(cè)試 d 1、d 7，參照 Bianchi等［5］方法測(cè)定各組大鼠熱縮足潛伏期(PWTL)。每只大鼠重復(fù)測(cè)定5次，最長(zhǎng)照射時(shí)間為20 s以防組織損傷，刪除最大和最小值，取平均值作為大鼠的基礎(chǔ)潛伏期。測(cè)定基礎(chǔ)PWL后，皮下注射嗎啡10 mg·kg－1后30 min測(cè)定每組大鼠的PWL，取其平均值作為鎮(zhèn)痛閾值并計(jì)算最大鎮(zhèn)痛效應(yīng)百分比(%MPE)，即%MPE=(鎮(zhèn)痛閾值－基礎(chǔ)潛伏期)/(最長(zhǎng)照射時(shí)間－基礎(chǔ)潛伏期)×100%。

1.4 標(biāo)本收集 d 7，測(cè)試完各組大鼠行為學(xué)后，大鼠腹腔注射10%水合氯醛0.4 g·kg－1，其中4只留取腰膨大用于ERK和p-ERK含量的測(cè)定。另外4只經(jīng)左心室灌注4%多聚甲醛，留取腰膨大保存于4%多聚甲醛中，放于4℃冰箱保存，用于免疫組織化學(xué)檢測(cè)。

1.5 免疫印跡法(Western blot) 取腰膨大，組織勻漿，以15 000 r·min－1離心5 min后取上清液，采用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量，定量后加入相應(yīng)體積的Loading buffer和PBS緩沖液煮沸5 min使其變性。經(jīng)SDS凝膠電泳，轉(zhuǎn)至經(jīng)甲醛激活的PVDF膜，室溫下在5%脫脂牛奶中封閉1 h，兔抗大鼠ERK和p-ERK一抗(1∶1000，Cell Signaling Technology)4℃孵育過(guò)夜。d 2，5%脫脂牛奶洗5 min×3次，TBST洗5 min×3次，間隔洗，羊抗兔二抗(1∶1000，Cell Signaling Technology)室溫孵育 1 h，5% 脫脂牛奶洗5 min×3次，TBST洗5 min×3次，間隔洗，暗室內(nèi)增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)顯色曝光，內(nèi)參為 GAPDH(1 ∶1 000，Cell Signaling Technology)。應(yīng)用UN-SCAN-IT gel軟件分析免疫印跡條帶。

1.6 免疫組織化學(xué)染色 取腰膨大，置于4%多聚甲醛中固定24 h，蔗糖脫水沉底，行冰凍冠狀切片，厚約15μm。按標(biāo)準(zhǔn)免疫組化染色SP法進(jìn)行。一抗采用多克隆兔抗大鼠GFAP(1∶500，Santa Cruz Biotechnology)，濕盒4℃孵育36～48 h，生物素標(biāo)記的羊抗大鼠IgG，37℃孵育1 h，辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素，37℃孵育1 h，DAB 顯色、貼片、脫水、透明、封片。光鏡下觀察，攝片。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)采用±s表示，兩兩組間比較采用LSD檢驗(yàn)，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)測(cè)試 d 1，6組大鼠之間基礎(chǔ)熱痛閾和MPE值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。d 7，各組大鼠在皮下注射嗎啡前基礎(chǔ)PWL無(wú)差異(Tab 1)。皮下注射10 mg·kg－1嗎啡30 min后，與Ⅰ組相比，Ⅱ組和Ⅳ組大鼠的MPE值明顯降低。與Ⅱ組相比，Ⅲ、Ⅴ和Ⅵ組大鼠的MPE值均升高(P＜0.05)，但Ⅳ組差異比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fig 1)。

Tab 1 PWL of each group before subcutaneous injection of morphine(±s，n=8)

Tab 1 PWL of each group before subcutaneous injection of morphine(±s，n=8)

Group Basic PWL/s d 1 d 7Ⅰ9.97 ±1.54 9.94 ±1.54Ⅱ9.83 ±0.74 9.85 ±0.73Ⅲ9.22 ±0.70 9.23 ±0.70Ⅳ9.91 ±1.60 9.87 ±1.59Ⅴ10.59 ±1.03 10.56 ±1.03Ⅵ10.11 ±0.89 10.05 ±0.88

Fig 1 %MPE at 30min of rats on day 1 and day 7

2.2 ERK和p-ERK的表達(dá) 各組大鼠腰5脊髓內(nèi)總ERK的表達(dá)無(wú)明顯差異。與Ⅰ組相比，Ⅱ組和Ⅳ組腰5脊髓內(nèi)p-ERK表達(dá)量明顯升高;與Ⅱ組相比，Ⅴ、Ⅳ組腰5脊髓內(nèi)p-ERK表達(dá)量明顯降低(P＜0.05)(Fig 2)。

Fig 2 Expression of ERK and p-ERK in L5 spinal cord

2.3 GFAP的表達(dá) 免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，Ⅰ組和Ⅲ組大鼠腰5脊髓背角僅有少量的GFAP表達(dá)，而Ⅱ組大鼠腰5脊髓背角GFAP表達(dá)量明顯增多。與Ⅱ組相比，皮下50 μg·kg－1右美托咪定處理組即Ⅵ組大鼠腰5脊髓背角GFAP表達(dá)量明顯減少(Fig 3)。

3 討論

嗎啡是一種強(qiáng)效的止痛劑，然而反復(fù)使用卻會(huì)形成耐受狀態(tài)，其確切的病理機(jī)制仍然不是很清楚。近年來(lái)脊髓膠質(zhì)細(xì)胞活化在嗎啡耐受發(fā)生和維持中的作用逐漸被認(rèn)識(shí)。2001年Song等［1］首次報(bào)道腹腔連續(xù)注射嗎啡可導(dǎo)致明顯的嗎啡耐受，同時(shí)引起大鼠脊髓、后扣帶回皮層以及海馬的星形膠質(zhì)細(xì)胞明顯肥大;鞘內(nèi)給予非特異性膠質(zhì)細(xì)胞抑制劑——氟枸櫞酸，能明顯緩解嗎啡鎮(zhèn)痛作用的耐受以及星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物角質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)免疫活性的增強(qiáng)。抑制膠質(zhì)細(xì)胞的活性已經(jīng)被證實(shí)能減弱嗎啡耐受的形成［6］。給予膠質(zhì)細(xì)胞抑制劑丙戊茶堿能明顯抑制膠質(zhì)細(xì)胞的活性，緩解嗎啡耐受［7］。此后大量的報(bào)道證明多種非特異性膠質(zhì)細(xì)胞抑制劑如:己酮可可堿［8］、米諾環(huán)素［9］等能明顯緩解嗎啡耐受。這些研究均提示了通過(guò)調(diào)控膠質(zhì)細(xì)胞，特別是星形膠質(zhì)細(xì)胞的活性可以有效的預(yù)防嗎啡耐受的形成和發(fā)展。

研究發(fā)現(xiàn)，嗎啡能引起 ERK的磷酸化［10］。鞘內(nèi)注射ERK抑制劑能減弱神經(jīng)損傷引起的痛覺(jué)過(guò)敏［11］。大鼠鞘內(nèi)連續(xù)注射嗎啡7 d后脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞中磷酸化的ERK明顯增多，而抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞中ERK通路的激活能夠緩解嗎啡耐受［12－13］。磷酸化的ERK能激活膠質(zhì)細(xì)胞，刺激炎性分子的產(chǎn)生和釋放并放大疼痛信號(hào)［14］。Liu等［4］研究發(fā)現(xiàn)注射DEX能明顯抑制坐骨神經(jīng)結(jié)扎大鼠脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞的肥大和ERK信號(hào)通路的活化。DEX腹膜內(nèi)注射，從炎癥早期開始，明顯抑制單關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)的熱痛覺(jué)過(guò)敏和脊髓膠質(zhì)細(xì)胞的活化，特別是星形膠質(zhì)細(xì)胞［15］。因此我們認(rèn)為DEX可能具有預(yù)防嗎啡耐受的作用。

由于DEX的高脂溶性，全身注射后能快速通過(guò)血腦屏障激活中樞神經(jīng)系統(tǒng)的α2受體，所以在本實(shí)驗(yàn)中選擇皮下注射。皮下注射更容易操作，但很明顯，和鞘內(nèi)給藥相比會(huì)需要更大劑量。在本實(shí)驗(yàn)中觀察到在高劑量DEX作用下，大鼠出現(xiàn)嗜睡現(xiàn)象，但24 h后對(duì)老鼠活動(dòng)未見(jiàn)明顯影響。因?yàn)镈EX的半衰期大約是2 h，所以本實(shí)驗(yàn)中DEX的注射時(shí)間是每天7∶30，而行為學(xué)測(cè)試時(shí)間為d 7為8∶00以盡量減少DEX本身的鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛影響。

Fig 3 Expression of GFAP in dorsal horn of spinal cord

在嗎啡耐受過(guò)程中，降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)水平升高，而阻斷CGRP受體能減弱嗎啡耐受的形成［13］。α2受體的活化能減少CGRP、興奮性氨基酸的釋放，它們與嗎啡耐受的形成密切相關(guān)。DEX可能通過(guò)減少這些物質(zhì)的釋放從而抑制了星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化。和我們的結(jié)果相反，Peng等［16］的研究表明用50 nmol·L－1DEX處理體外培養(yǎng)的膠質(zhì)細(xì)胞能增加ERK的表達(dá)，而高濃度的DEX對(duì)ERK的表達(dá)沒(méi)有影響。ERK是多種刺激觸發(fā)的共同信號(hào)通路，它的角色是廣泛和復(fù)雜的，其活化的程度，表達(dá)的位置，ERK表達(dá)的結(jié)果會(huì)隨著刺激的不同而改變［17］。胞內(nèi) Ca2+離子濃度的升高和NMDARs的活化對(duì)ERK的活化非常重要。Zheng等［18］證實(shí) DEX能抑制脊髓內(nèi) NMDARs的活化。DEX對(duì)p-ERK抑制作用的機(jī)制仍不是很清楚，可能通過(guò)抑制NMDARs活化或激活神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞膜上的α2受體從而影響胞內(nèi)Ca2+濃度進(jìn)而影響了p-ERK的表達(dá)從而抑制了星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化。但是具體的機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。

綜上所述，DEX能預(yù)防正常大鼠嗎啡耐受的形成且與劑量有關(guān)，這可能與其有效地抑制了脊髓內(nèi)ERK的磷酸化及星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化有關(guān)。本研究結(jié)果為臨床上降低單一用藥的劑量和不良反應(yīng)，提高對(duì)藥物的耐受性，加快起效時(shí)間，延長(zhǎng)鎮(zhèn)痛時(shí)間等提供新選擇。

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