左氧氟沙星經(jīng)胃轉(zhuǎn)運、分布特點的研究

鮑峻峻，許建明，胡詠梅，梅 俏，石 海，鄭海倫，李見春

(安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院1.腔鏡中心、2.消化內(nèi)科，消化病重點實驗室，安徽 合肥 230022;3.蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，安徽蚌埠 233000;4.蚌埠醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，安徽蚌埠 233000)

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，簡稱 H.pylori，Hp)現(xiàn)已證實是多種上消化系統(tǒng)疾病發(fā)生的最重要致病因子，應(yīng)用抗菌藥物根除Hp具有十分重要的臨床意義［1］。從藥理學(xué)角度分析，抗菌藥物治療成功與否取決于感染部位藥物的濃度。由于Hp特異性定植于胃粘液及其下方黏膜表面［2］，因此，只有抗菌藥物在其定植部位濃度達(dá)到所需殺菌濃度方可起效?？咕幬镂竷?nèi)轉(zhuǎn)運具有特殊的藥代動力學(xué)特點，存在胃內(nèi)直接分布及腸道吸收后由血轉(zhuǎn)運至胃組織的跨膜轉(zhuǎn)運，其中抗菌藥物由血轉(zhuǎn)運至胃致其胃內(nèi)局部濃度升高的決定性因素，從而成為殺滅Hp根除成功的關(guān)鍵［3］。

近年來Hp耐藥情況日益嚴(yán)重，經(jīng)典的三聯(lián)療法——質(zhì)子泵抑制劑(proton pump inhibitors，PPI)聯(lián)合抗菌藥物克拉霉素(clarithromycin)、阿莫西林(amoxicillin)或甲硝唑(metronidazole)根除失敗率逐年升高，根除率已低于或遠(yuǎn)低于80%，單純延長經(jīng)典三聯(lián)療法的療程，根除率也僅提高5%［4］。因此，急需選擇新的一線替代治療方案或二線方案。其中，含有左氧氟沙星的方案是主要推薦方案之一。雖然左氧氟沙星已檢出耐藥株，部分地區(qū)耐藥率也較高［5］，但含左氧氟沙星的三聯(lián)方案根除率仍超過80%，我國 2012 年共識意見［1］、Maastricht IV［6］和美國 College of Gastroenterology 指南［7］仍把含左氧氟沙星的三聯(lián)治療方案推薦作為一線替代方案或補救方案，并已逐漸廣泛應(yīng)用。但目前缺乏針對左氧氟沙星胃內(nèi)轉(zhuǎn)運、分布特點的基礎(chǔ)研究，有必要對左氧氟沙星胃內(nèi)轉(zhuǎn)運、分布特點進(jìn)行研究。

綜上所述，本課題擬在建立研究抗菌藥物胃內(nèi)轉(zhuǎn)運、分布的動物模型基礎(chǔ)上，初步探討左氧氟沙星在大鼠胃內(nèi)轉(zhuǎn)運、分布特點，從而為臨床應(yīng)用左氧氟沙星根除Hp過程中的藥代動力學(xué)的特點提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物試驗 取清潔級Wistar大鼠80只(購于南京醫(yī)科大學(xué)動物中心)，♂，體質(zhì)量250～300 g，隨機進(jìn)行分組，每組各40只。試驗為平行隨機試驗，試驗動物按左氧氟沙星(左氧氟沙星原料藥純度＞99.9%，由北京雙鶴藥業(yè)股份公司提供)給藥劑量的不同分為左氧氟沙星50、100 mg·kg－1組 (分別模擬人體 500、1000 mg·d－1劑量)。

試驗前24 h大鼠禁食、不限水。大鼠稱重后，按 3 ml·kg－1劑量給予 0.6 mol·L－1水合氯醛腹腔注射麻醉，妥善固定后開腹，于十二指腸距幽門2 cm處用電刀切開，將一個橡膠軟管通過十二指腸切口經(jīng)幽門插入胃腔。用生理鹽水充分沖洗，直至吸出液中無殘渣為止。隨后，大鼠根據(jù)劑量組不同，分別按50、100 mg·kg－1計算所需左氧氟沙星劑量，精確稱量所需左氧氟沙星后，溶于2 ml注射用生理鹽水，震蕩器30s待藥物充分溶解后，自大鼠外周靜脈勻速快速推注(推注時間為10～15 s)。隨后分別在15、30、45、60、75、90、105、120 min 時，經(jīng)腹主動脈取血處死動物;立刻行食道和十二指腸結(jié)扎，迅速分離胃組織，用生理鹽水清洗外部后，完全收集胃液，自胃小彎處沿軸線方向剖開胃組織，胃組織按前胃、腺胃(分為胃體和胃竇)采用水泡法［8］剝離胃黏膜組織。剝離的胃黏膜經(jīng)稱重后，進(jìn)行研磨勻漿，并按1∶9比例用生理鹽水稀釋。所有胃液和胃黏膜勻漿組織稀釋液樣本經(jīng)隱血試紙檢測，陽性和強陽性樣本不予保留，弱陽性或可疑陽性樣本保留。

血液樣本按各時間點收集后，經(jīng)5 000 r·min－1離心10 min，取血清 －80℃保存待用;胃液樣本按時間點收集后，精確計量體積，經(jīng)5 000 r·min－1離心10 min，取上清液 －80℃保存待用;胃黏膜勻漿稀釋液經(jīng)5 000 r·min－1離心10 min，取上清液－80℃保存待用。

1.2 HPLC 方法［9］

1.2.1 色譜條件 HPLC分析系統(tǒng)由Shimadzu LC-20AT高壓泵，SPD-20AV UV檢測器，SIL-20A自動進(jìn)樣器，CTO-20AC溫控箱和Lcsolution分析系統(tǒng)組成。Kromosil C18柱配合C18保護(hù)預(yù)柱作為分析柱，柱溫維持50℃;流動相［乙腈 －50 mmol·L－1檸檬酸 －1 mol·L－1醋酸銨 (19 ∶80 ∶1;V/V)］，流速為1.0 ml·min－1;分析所需波長為295 nm，靈敏度為0.01aufs;進(jìn)樣體積為 20 μl，運行時間為 6 min［10］。1.2.2 線性范圍 用空白大鼠血清、胃液和胃黏膜組織勻漿稀釋液將各樣本母液(1 g·L－1)稀釋配制1.0、5.0、10.0、50.0、100.0 mg·L－1濃度范圍標(biāo)準(zhǔn)溶液待用。質(zhì)控點樣本(QC)選擇3種生物樣本標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為1.0、10.0 和100.0 mg·L－1，用以驗證本方法。

1.2.3 樣本處理方法 所有樣本均冷凍保存于－80℃。處理前，冷凍樣本在室溫狀態(tài)下解凍。①血清樣本。100 μl樣本置于試管中，加入等體積100 g·L－1三氯乙酸沉淀蛋白，渦旋 2 min，12 000 r·min－1速度離心 10 min，收集上清，取 20 μl用于分析。②胃液和胃黏膜組織樣本。100 μl樣本置于試管中，加入等體積甲醇沉淀蛋白，渦旋2 min，12 000 r·min－1速度離心 10 min，收集上清，取 20 μl用于分析。

1.2.4 HPLC方法驗證 重點對HPLC方法的選擇性、線性、準(zhǔn)確度、精密度、穩(wěn)定性、靈敏度進(jìn)行驗證。

1.2.4.1 選擇性 為評價選擇性，選取大鼠/人血清、胃液、胃黏膜空白組織樣本各6份進(jìn)行檢測以確定空白樣本對藥物出峰信號無干擾。實驗要求，空白組織對藥物出峰位置無內(nèi)源性干擾信號。

1.2.4.2 線性 將配制完成的大鼠血清、胃液、胃黏膜組織標(biāo)準(zhǔn)溶液用于HPLC檢測，藥物峰面積采用外標(biāo)法(external standard method)比較濃度并求出回歸方程，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性程度采用相關(guān)系數(shù)(r)表示，一般r應(yīng)不小于0.99。每個濃度樣本檢測5次。

1.2.4.3 準(zhǔn)確度 采用相對回收率評價此HPLC

方法檢測大鼠血清、胃液、胃黏膜組織的準(zhǔn)確度，其計算方法是QC樣本按HPLC方法測定得出相應(yīng)峰面積，QC樣本每個濃度至少測定5份樣本，將測得峰面積代入回歸方程，求得的計算濃度，計算濃度除以理論濃度，即為相對回收率，要求所有回收率應(yīng)大于80%。

1.2.4.4 精密度 將低、中、高濃度的QC樣本在相同條件下在同一天檢測5次用來評價日內(nèi)(或批內(nèi))變異;在連續(xù)3天內(nèi)每天檢測2次用來評價日間(或批間)變異，評價指標(biāo)為RSDs(relative standard deviations)，要求各QC濃度點RSD不應(yīng)大于15%。

1.2.4.5 穩(wěn)定性 低、中、高濃度的QC樣本分別在室溫狀態(tài)下解凍后及保存2、4、6、8 h后進(jìn)行檢測，用來評價左氧氟沙星在室溫狀態(tài)下的穩(wěn)定性;另取樣本保存于－20℃ 1個月，每份標(biāo)本每周解凍檢測1次，用來評價藥物在－20℃狀態(tài)下的穩(wěn)定性。

1.2.4.6 靈敏度 在標(biāo)準(zhǔn)溶液最低濃度和空白樣本最大噪音值，LOD是基于信噪比(S/N:3)為3計算。LOQ則是基于信噪比為10計算。

1.3 藥代動力學(xué)分析

1.3.1 大鼠不同部位左氧氟沙星藥代動力學(xué)分析方法

1.3.1.1 大鼠中左氧氟沙星血濃度及藥動學(xué)參數(shù)根據(jù)大鼠各實驗組實測各時間點血藥濃度得出藥時曲線;計算并比較2種劑量組血漿藥物濃度－時間曲線下面積(AUC)，血清除率(CL)，達(dá)峰時間(Tmax)，峰濃度(Cmax)。

1.3.1.2 左氧氟沙星在大鼠胃液、胃黏膜中濃度及分布和轉(zhuǎn)運 根據(jù)不同劑量組各時間點的胃液和不同部位胃黏膜組織藥物濃度得出藥時曲線;分別比較不同劑量組各時間點胃液、胃黏膜組織藥物濃度。計算相應(yīng)的胃清除率和藥物胃內(nèi)轉(zhuǎn)運分?jǐn)?shù)，所用計算公式為［11］:

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 以大鼠血清中左氧氟沙星濃度采用DAS2.0軟件中非房室模型法計算PK參數(shù)。本課題所得實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計均在SPSS 14.0 for Windows統(tǒng)計軟件包中完成。2劑量組不同組織的藥物濃度及PK參數(shù)二組間比較選用t檢驗，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 左氧氟沙星血清、胃液及胃黏膜中HPLC測定結(jié)果 如Fig 1－3，大鼠血清、胃液和胃黏膜空白組織樣本對藥物出峰無內(nèi)源性干擾信號。大鼠血清、胃液和胃黏膜樣本中左氧氟沙星濃度與峰面積比的線性相關(guān)評價范圍均確定在1－100 mg·L－1，相關(guān)系數(shù)值均為r2=0.999，提示在各自濃度范圍內(nèi)檢測大鼠血清、胃液、胃黏膜內(nèi)左氧氟沙星濃度均顯示出良好的線性相關(guān)，其組織線性方程分別為=0.0000272X－0.310，=0.0000132X－0.099，=0.0000157X－0.110。此外，如Tab 1結(jié)果所示，準(zhǔn)確度、精密度、穩(wěn)定性、靈敏度均符合研究要求。建立HPLC方法后，對大鼠血清、胃液及不同部位胃黏膜組織樣本進(jìn)行檢測，并通過血清、胃液及胃黏膜組織的線性方程進(jìn)行計算，得出藥物濃度。

2.2 大鼠胃內(nèi)左氧氟沙星轉(zhuǎn)運、分布特點

2.2.1 大鼠不同劑量左氧氟沙星胃內(nèi)分布濃度比較 如Tab 2所示，左氧氟沙星50、100 mg·kg－1劑量組各時間點各部位藥物濃度分布結(jié)果相類似。50 mg·kg－1劑量組自45 min時間點起，胃液左氧氟沙星濃度逐漸升高，高于血藥濃度(P＜0.05);100 mg·kg－1劑量自60 min開始，胃液左氧氟沙星濃度逐漸升高，高于血藥濃度(P＜0.05)。

2劑量組均自15 min時間點起，胃體、胃竇左氧氟沙星濃度即高于血藥濃度及前胃左氧氟沙星濃度(P＜0.05);胃體和胃竇左氧氟沙星濃度差異無顯著性。而前胃左氧氟沙星濃度與血藥濃度相比，除15 min時間點外差異無顯著性。2劑量組間比較，胃液、前胃、胃體左氧氟沙星濃度自90 min時間點起開始差異有顯著性(P＜0.05)，但胃竇左氧氟沙星濃度無差異(P＞0.05)。

Fig 1 Chromatogram of blank serum(A)，and blank serum added levofloxacin(B)of rats，the serum after levofloxacin administered to rats(C)

Fig 2 Chromatogram of blank gastric juice(A)，and blank gastric juice added levofloxacin(B)of rats，the gastric juice after levofloxacin administered to rats(C)

Fig 3 Chromatogram of blank gastric mucosa(A)，and blank gastric mucasa added levofloxacin(B)of rats，the gastric mucosa after levofloxacin administered to rats(C)

Tab 1 Accuracy，precision，stability and sensitivity of the HPLC method for the analysis of the levofloxacin in serum，gastric juice，gastric mucosa of rats

Tab 2 Concentration of levofloxacin of serum，gastric juice and all parts of stomach at doses of 50 mg·kg－1and 100 mg·kg－1in rats

Tab 3 Pharmacokinetic parameters of levofloxacin after intravenous infusion in 2h at dose of 50 mg·kg－1，100 mg·kg－1in rats

左氧氟沙星50 mg·kg－1劑量組胃清除率為1.13 L·h－1·kg－1，轉(zhuǎn)運分?jǐn)?shù)為 2.36;100mg·kg－1劑量組胃清除率為1.18 L·h－1·kg－1，轉(zhuǎn)運分?jǐn)?shù)為2.52。

2.2.2 大鼠不同劑量左氧氟沙星胃內(nèi)各組織藥物濃度/血藥濃度%比較 50·kg－1組自30 min起，100 mg·kg－1組自45 min 起，胃液(藥物濃度/血藥濃度)%、胃體(藥物濃度/血藥濃度)%、胃竇(藥物濃度/血藥濃度)%明顯高于前胃(藥物濃度/血藥濃度)%(P＜0.05);隨給藥時間延長，50 mg·kg－1組給藥后75 min起，100 mg·kg－1組自60 min起，胃液(藥物濃度/血藥濃度)%明顯高于胃體(藥物濃度/血藥濃度)%、胃竇(藥物濃度/血藥濃度)%(P＜0.05);胃體(藥物濃度/血藥濃度)%、胃竇(藥物濃度/血藥濃度)%，差異無顯著性。

而2劑量組的胃液(藥物濃度/血藥濃度)%、前胃(藥物濃度/血藥濃度)%、胃體(藥物濃度/血藥濃度)%、胃竇(藥物濃度/血藥濃度)%，差異無顯著性。

2.2.3 大鼠不同劑量左氧氟沙星藥動學(xué)參數(shù)比較

Tab 3列出左氧氟沙星 50、100 mg·kg－1組部分藥動學(xué)參數(shù)。其中，所測時點中Cmax分別為33.17 mg·L－1、43.97 mg·L－1，Tmax均為 0.25 h。比較 2組AUC(0－2h)間差異有顯著性(P＜0.05);而2組血清除率及胃清除率差異無顯著性(P＞0.05)。

3 討論

本文結(jié)果顯示，在2 h取材時間內(nèi)，左氧氟沙星50、100 mg·kg－1劑量組胃液和胃各部位左氧氟沙星濃度總體趨勢大致相似，胃液、胃體、胃竇組織中藥物濃度與血藥濃度百分比在不同時點的數(shù)值為150%～600%，提示左氧氟沙星在胃液及胃內(nèi)組織易于集聚，轉(zhuǎn)運能力較強，但胃體和胃竇分布無差異。

在所選2 h取材時間內(nèi)，胃液左氧氟沙星濃度隨時間點呈上升趨勢，除前期幾個時間點外，胃液左氧氟沙星濃度均明顯高于血藥濃度(增高比例為300%～500%)。據(jù)此，推測左氧氟沙星在胃內(nèi)可能存在主動轉(zhuǎn)運。原因如下:克拉霉素作為目前公認(rèn)胃內(nèi)存在主動轉(zhuǎn)運的藥物，阿莫西林胃內(nèi)幾乎不轉(zhuǎn)運，其轉(zhuǎn)運分?jǐn)?shù)分別為2.28和0.15［12］，對比二者轉(zhuǎn)運分?jǐn)?shù)，左氧氟沙星在胃內(nèi)的轉(zhuǎn)運分?jǐn)?shù)為2.50左右，提示可能存在胃內(nèi)主動轉(zhuǎn)運;另外，左氧氟沙星在腎臟和小腸內(nèi)均已證實存在主動轉(zhuǎn)運。據(jù)此，推測左氧氟沙星胃內(nèi)可能存在主動轉(zhuǎn)運，將進(jìn)一步通過體外實驗計算有關(guān)米氏方程及其米氏參數(shù)，進(jìn)一步證實左氧氟沙星胃內(nèi)轉(zhuǎn)運類型。此外，結(jié)果顯示，大鼠胃內(nèi)左氧氟沙星分布存在差異，腺胃左氧氟沙星濃度明顯高于前胃左氧氟沙星濃度，但胃體和胃竇分布無明顯差異。由于人體胃內(nèi)并無前胃的結(jié)構(gòu)，因此，是否可以據(jù)此推斷人體胃內(nèi)分布存在差異，仍需下一步的人體試驗加以證實。

本課題選擇實驗時間為2 h，可能無法完全模擬藥物在人體內(nèi)的作用，主要原因是配合下一步課題組即將進(jìn)行的體外實驗，由于胃黏膜組織體外試驗一般多選擇2 h的試驗時間，此外，試驗的目的是研究左氧氟沙星胃內(nèi)的轉(zhuǎn)運和分布特點，故前期的體內(nèi)試驗也同樣選擇2 h，并選擇相同的試驗點。由于總體試驗時間較短，對比50和100 mg·kg－1組，所有時間點胃液和各部位胃黏膜濃度均高于左氧氟沙星對 Hp 的 MIC50(0.25 mg·L－1)［13］，因此，無法單純從藥物濃度與MIC值關(guān)系來比較兩劑量組的優(yōu)劣。此外，有文獻(xiàn)認(rèn)為，左氧氟沙星用于根除 Hp 250 mg，1天2次和500 mg，1天1次的療效基本相當(dāng);通過增加左氧氟沙星的劑量(如500 mg，1天2次)及療程并不增加療效，對 Hp根除率并無增加［14］，加之 1 000 mg·d－1劑量的安全性在我國人群中尚無相關(guān)研究數(shù)據(jù)，故目前仍推薦使用500 mg·d－1劑量。驗證兩劑量組的優(yōu)劣需延長實驗時間點特別是比較12 h或24 h胃液或各部位胃黏膜左氧氟沙星濃度與MIC間的關(guān)系。

此外，臨床進(jìn)行Hp根除治療基本都是采用口服給藥，從口服藥物到最終起效，存在兩個起效階段，即胃內(nèi)直接分布以及腸道吸收后由血至胃組織的跨膜轉(zhuǎn)運。整個轉(zhuǎn)運、分布過程參與的環(huán)節(jié)眾多，影響其中任一環(huán)節(jié)的因素均可影響Hp根除效果。但無論如何，從血轉(zhuǎn)運至胃是Hp根除成功的關(guān)鍵，加之口服抗菌藥物更易受其它因素干擾，故本課題采用靜脈給藥方式，將前期可能對研究結(jié)果造成影響的因素進(jìn)行排除，重點考察抗菌藥物由血轉(zhuǎn)運至胃的情況及特點，另一方面胃液內(nèi)左氧氟沙星濃度高，推測左氧氟沙星同樣可通過局部直接作用對胃黏膜和胃粘液層內(nèi)定植的Hp起作用。至于左氧氟沙星口服胃內(nèi)直接分布特點，將在今后的研究中進(jìn)一步考察。

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