吡格列酮對腎小球系膜細胞ROS和p38MAPK的影響

汪 姍，葉山東，孫文佳，劉 皆，胡圓圓

(安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院內(nèi)分泌科，安徽合肥 230001)

近來研究發(fā)現(xiàn)胰島素增敏劑吡格列酮(pioglitazone，PIO)除降糖外尚具有抗炎、抗氧化等的作用［1－2］，其腎臟保護作用日益受到關注，確切機制尚未明確。p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK)是糖尿病多種致病因素的共同信號通路的交匯點，參與了糖尿病腎臟細胞外基質(zhì)重構和腎臟進行性纖維化［3］。有關吡格列酮是否通過p38MAPK發(fā)揮腎保護作用尚少見報道。本實驗通過體外培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細胞，觀察PIO對高糖培養(yǎng)下的腎小球系膜細胞氧化應激及p38MAPK的影響，探討PIO的腎保護機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞來源 大鼠腎小球系膜細胞(MCs)購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.1.2 主要藥物及試劑 DMEM培養(yǎng)液購自美國Hyclone公司，胎牛血清購自杭州四季青公司;吡格列酮由江蘇恒瑞醫(yī)藥公司惠贈;2'，7'-二氯雙氫熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)購自美國Sigma公司;TRIzol購自美國Invitrogen公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及PCR試劑購自大連寶生物公司;PCR所用引物由廣州瑞真生物技術有限公司設計。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組 MCs常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM液中(Glu 5.6 mol·L－1)，置 37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細胞以2×105/孔的密度接種于6孔細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h，待細胞達到亞融合狀態(tài)，換用含1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液(Glu 5.6 mol·L－1)繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使細胞生長同步化，然后按下列分組進行處理:①正常對照組(NG組):DMEM細胞培養(yǎng)液(Glu 5.6 mol·L－1);②高糖組(HG組):DMEM細胞培養(yǎng)液(Glu 2 mol·L－1);③吡格列酮1組(PIO 1 組):HG+ 吡格列酮(10－7mol·L－1);④吡格列酮2組(PIO 2組):HG+吡格列酮(10－6mol·L－1);⑤吡格列酮3組(PIO 3組):HG+吡格列酮(10－5mol·L－1)。不同濃度吡格列酮預先干預24 h。以上各組標本培養(yǎng)48 h后，分別收集細胞和培養(yǎng)上清液，每個檢測指標均設6個重復組。

1.2.2 RT-PCR檢測系膜細胞p38MAPK mRNA表達 TRIzol法提取細胞總RNA，紫外分光光度儀測定A260/A280值在1.8～2.0之間，計算 RNA含量。取2 μg總RNA按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，反應體積為10 μl。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物分別進行p38MAPK及管家基因3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)的擴增。所用引物由大連寶生物有限公司合成。p38MAPK引物序列上游5'-TGT TGA CCG GAA GAA CGT TGT-3'，下 游 5'-CAA AGT AGG CAT GCG CAA GAG-3'，反應條件為94℃預變性3 min，94℃變性30 s，55℃退火40 s，72℃延伸1 min的熱循環(huán)，循環(huán)35次后，終末72℃延伸10 min。以GAPDH為內(nèi)參照，94℃預變性3 min后，進入94℃ 30 s變性、52℃ 60 s退火、72℃ 60 s延伸的熱循環(huán)，循環(huán)35次，終末延伸72℃10 min。PCR產(chǎn)物在含溴化乙錠的1.5%瓊脂糖凝膠上電泳后拍照，進行吸光度掃描，以p38MAPK/GAPDH條帶光密度比值表示各因子mRNA的相對表達量。

1.2.3 流式細胞術檢測系膜細胞內(nèi)活性氧(ROS)水平 DCFH-DA本身無熒光，可自由進出細胞膜，在細胞內(nèi)可被ROS氧化為熒光物質(zhì)DCF，其形成量與細胞內(nèi)ROS成正比。待細胞長滿培養(yǎng)板底面80%時，去除原培養(yǎng)液，每孔加入2 ml培養(yǎng)液濃度為 20 μmol·L－1的 DCFH-DA 工作液，37℃ 避光孵育30 min，PBS沖洗3遍，用含3%FBS的PBS懸浮細胞，立即上機檢測。產(chǎn)生熒光的細胞為陽性細胞，不產(chǎn)生熒光的細胞為陰性細胞，以陽性細胞占所有細胞百分比表示各組細胞的相對熒光強度。

2 結(jié)果

2.1 PIO對高糖培養(yǎng)的系膜細胞內(nèi)ROS水平的影響 流式細胞術結(jié)果顯示，未加入DCFH-DA的陰性對照組有極微量自發(fā)熒光。與NG組相比，HG組細胞內(nèi)ROS生成量明顯增多(4.28±0.50vs17.3±0.49，P＜0.05)。不同濃度PIO預先干預后，細胞內(nèi)ROS生成量較HG組明顯減少，分別為PIO 1組(7.34±0.89)、PIO 2組(9.25±0.65)、PIO 3組(10.9±0.97)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，且組間差異有統(tǒng)計學意義。見Fig 1。

2.2 PIO對高糖培養(yǎng)的腎小球系膜細胞內(nèi)p38MAPK mRNA的表達 NG組系膜細胞可低水平表達 p38MAPK(0.73±0.06)，高糖刺激后，p38MAPK mRNA表達明顯增加(1.09±0.13vs0.73±0.06，P＜0.01)。與HG組比較，不同濃度PIO預先干預后，p38MAPK mRNA表達量較HG組明顯降低，分別為PIO 1組(0.98±0.09，P＜0.05)、PIO 2組(0.87±0.12，P＜0.01)、PIO 3組(0.81±0.08，P＜0.01)。PIO 1組與 PIO 2組(P＜0.05)、PIO 3組(P＜0.01)之間差異有統(tǒng)計學意義，但PIO 2、3兩組間差異無統(tǒng)計學意義。見Fig 2。

2.3 相關性分析 根據(jù)Pearson相關分析，MCs內(nèi)p38MAPK表達與ROS水平呈正相關(r=0.62，P＜0.01)，見 Fig 3。

3 討論

糖尿病腎病(DN)是以腎小球系膜細胞增殖、肥大以及細胞外基質(zhì)過度積聚為特點的腎臟病變。不少研究表明ROS和p38MAPK參與了糖尿病腎小球硬化的發(fā)生和發(fā)展，且兩者之間密切相關［3－4］。高糖狀態(tài)下ROS產(chǎn)生過度，增強p38MAPK活化程度，后者通過上調(diào)轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)、核因子-κB(NF-κB)、纖維黏連蛋白(FN)的表達，加劇腎臟進行性纖維化。Fang等［5］報道高糖刺激下細胞內(nèi)p38MAPK磷酸化水平明顯增強，且能被抗氧化劑NAC阻斷，提示氧化應激與p38MAPK信號通路的活化有著密切的關系。因此減輕氧化應激，阻斷p38MAPK通路，對DN的防治具有重要意義。

Fig 1 Levels of ROS in mesangial cells of all groups evaluated by flow cytometry

Fig 2 Expressions of p38MAPK mRNA in MCs in different groups evaluated by RT-PCR

Fig 3 Correlation between p38MAPK mRNA expression and levels of ROS in MCs

研究表明［1－2］，PIO 除降糖外，還可對抗高糖引起的氧化應激，抑制體內(nèi)炎癥因子表達。Ji等［6］在對小神經(jīng)膠質(zhì)細胞的研究中發(fā)現(xiàn)，PIO可抑制p38MAPK活化，降低脂多糖誘導的iNOS的表達和NO的生成，調(diào)節(jié)炎癥過程而發(fā)揮對神經(jīng)細胞的保護作用。本實驗研究顯示，高糖刺激后，MCs ROS生成明顯增多，p38MAPK mRNA表達上調(diào)，細胞處于明顯的氧化應激狀態(tài)。PIO預先干預后，高糖誘導的ROS和p38MAPK mRNA高表達均有所緩解，提示PIO可減輕高糖誘導的MCs p38MAPK表達和氧化應激程度，并具有一定的濃度依賴性，與文獻報道一致［5］。有關PIO抑制MCs p38MAPK表達確切機制尚未明確，可能與其上調(diào)PPAR-γ表達，拮抗p38MAPK 有關［7］。

總之，本研究結(jié)果提示PIO可降低高糖誘導的MCs p38MAPK mRNA表達和氧化應激水平，且呈濃度依賴性，該作用可能與其腎臟保護部分有關。

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