4-氨基-2-三氟甲基苯基維甲酸酯通過(guò)PTEN/PI3K/Akt抑制YAC-1細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)其分化

彭曉清，陳飛虎，葛金芳，汪 楠，潘春曉，雷 靜

(安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，安徽合肥 230032)

全反式維甲酸 (all trans retinoic acid，ATRA)在細(xì)胞生長(zhǎng)和分化過(guò)程中起重要調(diào)節(jié)作用，常做化療藥物和腫瘤形成抑制劑［1］。眾所周知，ATRA能誘導(dǎo)急性早幼粒細(xì)胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)細(xì)胞逐漸向正常細(xì)胞分化從而達(dá)到治愈目的，但長(zhǎng)期用藥導(dǎo)致維甲酸綜合征［2］和耐藥［3］等不良反應(yīng)。本課題組前期以ATRA為先導(dǎo)化合物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)優(yōu)化和篩選，結(jié)果表明4-氨基-2-三氟甲基苯基維甲酸酯 (4-amino-2-trifluoromethyl-phenyl retinate，ATPR)可抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其分化成熟［4，9］，并已申請(qǐng)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)(專利公開(kāi)號(hào):CN101591280、CN102008443A)，有望成為一種新型抗腫瘤藥物。

cyclinD在淋巴瘤的發(fā)生過(guò)程中起重要作用。有研究證實(shí)在淋巴瘤細(xì)胞中抑制Akt磷酸化從而降低cyclinD過(guò)表達(dá)能抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)［5］。PTEN/PI3K/Akt是經(jīng)典信號(hào)通路之一，在腫瘤中研究較為廣泛［6］，但是在誘導(dǎo)分化中的研究卻很少。因此本研究以鼠淋巴瘤細(xì)胞株YAC-1為研究對(duì)象，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)觀察ATPR對(duì)鼠淋巴瘤細(xì)胞增殖及分化的影響，并探討PTEN/PI3K/Akt通路和cyclinD在該過(guò)程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 新型維甲酸衍生物ATPR由安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院合成。純度為99.66%，溶于無(wú)水乙醇，配置成1×10－2mol·L－1濃度(使用終濃度中乙醇含量為0.02%)，－20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。RPMI 1640培養(yǎng)液為Gibco公司產(chǎn)品;胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司;瑞氏－吉姆薩染液購(gòu)自南京建成生物工程研究所;LY294002和LDH乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天公司;全反式維甲酸ATRA和TPA購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;NBT購(gòu)自Amresco公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒均為Promega公司產(chǎn)品;PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成;抗RARα抗體、抗RARβ抗體、抗PTEN抗體購(gòu)自安博公司;抗RARγ抗體購(gòu)自Abcam公司;抗β-actin、抗cyclinD抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;抗Akt、抗p-Akt抗體購(gòu)自Cell Signal公司;ECL化學(xué)發(fā)光劑購(gòu)自Thermo公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) YAC-1細(xì)胞株購(gòu)自中科院細(xì)胞庫(kù)，采用含10%胎牛血清(FCS)的RPMI 1640培養(yǎng)液，并加入青霉素0.1 IU·L－1和鏈霉素 100 mg·L－1的培養(yǎng)體系培養(yǎng)。培養(yǎng)環(huán)境為37℃，5%的CO2培養(yǎng)箱，每2 d換液1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖狀況 將YAC-1細(xì)胞以5×103個(gè)/孔的濃度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔為100 μl。實(shí)驗(yàn)分組分為空白對(duì)照組(加入RPMI 1640培養(yǎng)液)、溶劑對(duì)照組(0.02%無(wú)水乙醇)、ATRA 組(為陽(yáng)性對(duì)照組，濃度為 10－5mol·L－1)、ATPR 組(10－5、10－6、10－7、10－8、10－9mol·L－1)，每孔的終體積為 200 μl，分別在 24、48、72 h 時(shí)加入 MTT(濃度為 5 g·L－1)20 μl，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h 后，離心(159 ×g，5 min)棄上清，每孔加入150 μl的 DMSO，震蕩搖勻。酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)吸光度(A490)值，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次，取其平均值。

1.4 LDH法檢測(cè)細(xì)胞毒性 將YAC-1細(xì)胞以5×103個(gè)/孔的濃度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔為100 μl。實(shí)驗(yàn)分組為無(wú)細(xì)胞的培養(yǎng)液孔(背景空白對(duì)照孔)，未經(jīng)藥物處理的對(duì)照細(xì)胞孔(樣品對(duì)照孔)，未經(jīng)藥物處理的用于后續(xù)裂解的細(xì)胞孔(樣品最大酶活性對(duì)照孔)，以及“1.3”中的實(shí)驗(yàn)組別，終體積為200 μl。72 h 在樣品對(duì)照空加 LDH 釋放液20 μl，混勻，孵育1 h，離心(159 × g，5 min)吸取上清 120 μl轉(zhuǎn)移至新的96孔板中，每孔加入LDH檢測(cè)工作液60 μl，室溫孵育30 min。酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)吸光度(A490)值，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次，取其平均值。

1.5 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 將細(xì)胞以4×105個(gè)/孔的濃度接種于6孔板中，實(shí)驗(yàn)分組如“1.3”，每孔終體積2 ml。作用72 h后，收集細(xì)胞離心，加PBS重懸、混勻，滴加在載玻片上，自然風(fēng)干后，依次滴加瑞氏－吉姆薩染液A液和B液。流水沖洗細(xì)胞，干燥后在顯微鏡(400×)下觀察細(xì)胞形態(tài)，并拍照。

1.6 NBT還原實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞以4×105個(gè)/孔的濃度接種于6孔板，實(shí)驗(yàn)分組如“1.3”，作用72 h后，收集細(xì)胞。取500 μl新鮮配置含100 mg·L－1TPA的0.1%NBT溶液，分別與等體積經(jīng)不同處理后的細(xì)胞懸液混合，37℃孵育30 min后，離心去上清，沉淀涂片。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每孔觀察4個(gè)視野，計(jì)數(shù)NBT陽(yáng)性細(xì)胞(胞質(zhì)含藍(lán)灰色顆粒的細(xì)胞為陽(yáng)性細(xì)胞)，根據(jù)以下公式計(jì)算每個(gè)復(fù)孔的NBT陽(yáng)性率，比較組間差異。

1.7 半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和Western blot法檢測(cè)細(xì)胞 RARα，RARβ和 RARγ表達(dá)

1.7.1 RNA提取和 RT-PCR 將細(xì)胞以4×106個(gè)/孔的濃度接種于培養(yǎng)瓶中，實(shí)驗(yàn)分組為空白對(duì)照組(加入RPMI 1640培養(yǎng)液)、溶劑對(duì)照組(0.02%無(wú)水乙醇)、ATRA組(為陽(yáng)性對(duì)照組，濃度為10－5mol·L－1)、ATPR 組(10－5mol·L－1)。藥物作用細(xì)胞72 h后，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒結(jié)合說(shuō)明書(shū)及引物反應(yīng)條件進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和目的基因擴(kuò)增，檢測(cè)RARα、RARβ、RARγ基因的表達(dá)。各種引物序列和擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度見(jiàn) Tab 1。循環(huán)條件:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性40 s，退火 RARα (53℃)、RARβ (50℃)、RARγ (53℃)、β-actin(53℃)40 s，延伸72℃1 min。35個(gè)循環(huán)后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳(80 V，30 min)，用凝膠自動(dòng)成像2 000掃描和分析結(jié)果，以β-actin為內(nèi)參作相對(duì)定量分析。以3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

Tab 1 Oligonucleotide primer sequences used for RT-PCR analysis

1.7.2 Western blot 藥物作用72 h后，棄培養(yǎng)液，用預(yù)冷PBS洗滌3遍，每瓶加入400 μl RIPA裂解液(含10%PMSF)裂解30 min，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到1.5 ml EP管中，離心取上清，使用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。將上清與上樣緩沖液按4∶1的比例進(jìn)行分裝，100℃煮10 min變性，－80℃保存待用。50～100 μg蛋白經(jīng)12%SDS-PAGE膠分離后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。TBST洗膜10 min。含5%脫脂奶粉(TBST溶解)封閉2h。隨后加入一抗 (1∶500)4℃孵育過(guò)夜。TBST洗脫3次，每次5 min，孵育二抗1 h，TBST洗脫4次。均勻涂化學(xué)發(fā)光劑ECL于PVDF膜上，在Bioshine chemiQ4600曝光設(shè)備上曝光拍照。結(jié)果采用Image-Pro Plus圖像分析管理系統(tǒng)分析。

1.8 Weston blot檢測(cè) PTEN、Akt、p-Akt、cyclinD的表達(dá) 設(shè)空白對(duì)照組(加入RPMI 1640培養(yǎng)液)、溶劑對(duì)照組(0.02%無(wú)水乙醇)、ATRA組(為陽(yáng)性對(duì)照組，濃度為 10－5mol·L－1)、ATPR 組(10－5mol·L－1)、LY294002 抑 制 劑 組 (25 nmol· L－1)，LY294002(25 nmol·L－1)+ATPR 組(10－5mol·L－1)，檢測(cè) PTEN、Akt、p-Akt、cyclinD 蛋白的表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)步驟如“1.7.2”。

2 結(jié)果

2.1 ATPR對(duì)YAC-1細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用 如Tab 2所示，與空白對(duì)照組相比，溶劑對(duì)照組并無(wú)明顯變化，表明無(wú)水乙醇(0.02%)作為溶劑對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)影響，因此可排除溶劑對(duì)本實(shí)驗(yàn)的影響。ATPR(10－5、10－6、10－7、10－8、10－9mol·L－1)體外給藥42 h和72 h對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生不同程度的抑制作用，72 h抑制作用較強(qiáng)，并隨著藥物濃度升高抑制作用增強(qiáng)。

Tab 2 Effects of ATPR on the proliferation of YAC-1 cells detected by MTT assay(±s，n=3)

Tab 2 Effects of ATPR on the proliferation of YAC-1 cells detected by MTT assay(±s，n=3)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs solvent group

GroupConcentration/mol·L －1 A490 24 h 48 h 72 h Control 0.1483 ±0.0048 0.4800 ±0.0078 0.9240±0.0130 Solvent 0.1449 ±0.0044 0.4713 ±0.0090 0.9153 ±0.0073 ATPR 10 －5 0.1461 ±0.0043 0.3664 ±0.0073＊＊ 0.5921 ±0.0068＊＊10 －6 0.1471 ±0.0062 0.3869 ±0.0077＊＊ 0.6160 ±0.0090＊＊10 －7 0.1450 ±0.0065 0.4094 ±0.0062＊＊ 0.6737 ±0.0069＊＊10 －8 0.1490 ±0.0048 0.4521 ±0.0114* 0.7360 ±0.0064＊＊10 －9 0.1470 ±0.0043 0.4670 ±0.0071 0.8724 ±0.0084 ATRA 10 －5 0.1505 ±0.0056 0.4850 ±0.0048＊＊ 0.5768 ±0.0076＊＊

2.2 ATPR對(duì)YAC-1細(xì)胞毒性作用 如Fig 1所示，與溶劑組比較，ATPR(10－5～10－9mol·L－1)體外用藥72 h后，隨著藥物濃度的升高，藥物對(duì)細(xì)胞毒性增強(qiáng)，以藥物濃度10－6mol·L－1細(xì)胞毒性升高最為明顯(0.244±0.013)，與溶劑對(duì)照組比較(0.077±0.008)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

2.3 ATPR對(duì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)影響 YAC-1細(xì)胞在ATPR(10－5～10－9mol·L－1)作用72 h 后，瑞氏 －吉姆薩染色后顯微鏡(400×)觀察顯示，和空白組和溶劑對(duì)照組細(xì)胞相比，ATPR(10－5mol·L－1)細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，生長(zhǎng)疏松，細(xì)胞數(shù)量減少，核質(zhì)比減少，腫瘤細(xì)胞特點(diǎn)有一定改善。見(jiàn)Fig 2。

2.4 ATPR對(duì)分化細(xì)胞陽(yáng)性率的影響 如Tab 3所示，與溶劑組比較，ATPR(10－9mol·L－1)作用 72 h后對(duì)YAC-1細(xì)胞NBT陽(yáng)性細(xì)胞率無(wú)影響。但隨著 ATPR 劑量增加(10－5～10－9mol·L－1)，NBT 的陽(yáng)性細(xì)胞率逐漸增加，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，當(dāng)劑量增加到 10－5mol·L－1時(shí)，其誘導(dǎo)分化作用與ATRA相似。提示ATPR可誘導(dǎo)YAC-1細(xì)胞分化。

Fig 1 Cell cytotoxicity of YAC-1 cells detected by LDH(±s，n=6)

Tab 3 Effect of ATPR on the NBT positive cell in YAC-1 cells(±s，n=3)

Tab 3 Effect of ATPR on the NBT positive cell in YAC-1 cells(±s，n=3)

＊＊P＜0.01 vs solvent group

Group Concentration/mol·L －1Positive cell/%Control 5.00 ±2.00 Solvent 7.67 ±2.08 ATRA 10 －5 67.00 ±3.61＊＊ATPR 10 －5 65.30 ±2.52＊＊10 －6 53.00 ±4.00＊＊10 －7 38.00 ±2.00＊＊10 －8 27.67 ±3.79＊＊10－910.33 ±2.52

2.5 RARα、RARβ、RARγ mRNA 和蛋白的表達(dá)結(jié)果如Fig 3、4所示，與溶劑對(duì)照組比較，ATPR(10－5mol·L－1)作用 72 h 后，YAC-1 細(xì)胞 RARα的mRNA和蛋白表達(dá)量均明顯增加，而 RARβ、RARγ的mRNA和蛋白表達(dá)量則無(wú)明顯變化。

2.6 PTEN、Akt、p-Akt、cyclinD 蛋白的表達(dá)Western blot結(jié)果顯示，與溶劑對(duì)照組相比，ATPR(10－5mol·L－1)作用72 h后，YAC-1細(xì)胞 PTEN 蛋白表達(dá)量增加，而cyclinD和p-Akt的蛋白表達(dá)則明顯降低。PI3K抑制劑LY294002也可抑制YAC-1細(xì)胞的p-Akt和cyclinD的表達(dá)，并且LY294002作用6 h后加入ATPR(10－5mol·L－1)組p-Akt和cyclinD的表達(dá)最低。見(jiàn)Fig 5。

3 討論

Fig 2 Effect of ATPR on the morphological changes of YAC-1 cells after 72 h(400×)

20世紀(jì)70年代，Sachs發(fā)現(xiàn)在某些抑制增殖和誘導(dǎo)分化的物質(zhì)作用下小鼠白血病細(xì)胞系的異常分化是可逆的，因此提出了誘導(dǎo)分化治療(differentiation therapy)的概念，即應(yīng)用化學(xué)藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化并逆轉(zhuǎn)其增殖、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移等惡性表型，使其成為正?；蚪咏＜?xì)胞，從而達(dá)到治療的目的。全反式維甲酸是誘導(dǎo)分化治療的代表性藥物，對(duì)淋巴瘤等血液系統(tǒng)腫瘤有良好的治療作用［7］，但長(zhǎng)期應(yīng)用導(dǎo)致的耐藥性［2］及其他不良反應(yīng)［8］限制了其臨床應(yīng)用。本課題組前期研究中以ATRA為先導(dǎo)化合物設(shè)計(jì)合成了維甲酸衍生物ATPR，證實(shí)其可抑制食管癌、胰腺癌、宮頸癌等腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)分化［9］，但其對(duì)淋巴瘤的治療作用尚不明確。

Fig 3 RT-PCR analysis of YAC-1 cells retinoid acidreceptors mRNA expression after ATPR treatment(±s，n=3)

Fig 4 Effect of ATPR on protein expression of retinoid acid receptors in YAC-1 cells(±s，n=3)

Fig 5 Effect of ATPR on protein expression of PTEN，Akt，p-Akt，cyclin D in YAC-1 cells(±s，n=3)

本研究以鼠淋巴瘤YAC-1細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，觀察了ATPR對(duì)淋巴瘤的治療作用。結(jié)果表明，ATPR(10－5～10－9mol·L－1)體外用藥 72 h 可明顯抑制YAC-1細(xì)胞增殖，其中10－5mol·L－1ATPR 作用最為明顯，LDH實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示ATPR抑制YAC-1細(xì)胞增殖的作用可能與其細(xì)胞毒性作用相關(guān)。

細(xì)胞分化主要表現(xiàn)形態(tài)和功能兩個(gè)方面，形態(tài)分化是細(xì)胞分化的基本特征。形態(tài)學(xué)上的分化成熟是表明惡性腫瘤細(xì)胞分化的標(biāo)志［10］。經(jīng)過(guò)ATPR作用72 h的YAC-1細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上有趨向高分化狀態(tài)的改變。NBT還原試驗(yàn)是從功能及生物化學(xué)變化方面來(lái)反映細(xì)胞分化的常用指標(biāo)，且是目前公認(rèn)的反映細(xì)胞分化的敏感指標(biāo)之一［11－12］。本研究結(jié)果表明，ATPR(10－5～10－9mol·L－1)體外用藥72 h后YAC-1細(xì)胞的NBT細(xì)胞陽(yáng)性率明顯升高。以上結(jié)果提示，ATPR可抑制鼠YAC-1細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其分化。

維甲酸類藥物經(jīng)維甲酸結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核內(nèi)與核受體RARs或RXRs結(jié)合，激活目的基因，從而參與調(diào)控多種重要生理過(guò)程［13］。不同細(xì)胞中RARs分布不同，因此ATRA在不同細(xì)胞中可以激活不同的維甲酸受體亞基［14］。研究表明［7］，在淋巴瘤細(xì)胞中ATRA提高RARα和RXRγ介導(dǎo)的細(xì)胞周期阻滯和凋亡。本研究通過(guò)RT-PCR和Western blot方法觀察了ATPR對(duì)維甲酸受體RARs表達(dá)的變化，結(jié)果表明ATPR可誘導(dǎo)RARα的表達(dá)增加，但對(duì)RARβ和RARγ的表達(dá)無(wú)明顯影響，提示ATPR對(duì)YAC-1細(xì)胞的抑制增殖和誘導(dǎo)分化作用可能是通過(guò)和RARα結(jié)合實(shí)現(xiàn)。課題組前期研究結(jié)果表明ATPR對(duì)乳腺癌的抑制增殖和誘導(dǎo)分化作用則是通過(guò)調(diào)節(jié) RARβ和 RARγ的平衡實(shí)現(xiàn)［4］。進(jìn)一步證實(shí)維甲酸類藥物可通過(guò)不同腫瘤細(xì)胞中的不同RARs亞基發(fā)揮其治療作用。

腫瘤細(xì)胞中抑癌基因PTEN的缺失或表達(dá)下調(diào)可引起PIP3催化亞基的表達(dá)放大，進(jìn)一步激活PI3K/Akt通路的磷酸化［15］。Dal Col等［5］在套細(xì)胞淋巴瘤中發(fā)現(xiàn)通過(guò)增加GSK-3促進(jìn)Akt的依賴性蛋白酶降解，降低Akt的磷酸化，從而抑制cyclinD的過(guò)表達(dá)。本研究結(jié)果表明，ATPR(10－5mol·L－1)體外用藥72 h后YAC-1細(xì)胞的PTEN蛋白表達(dá)量增加，而cyclinD和p-Akt的蛋白表達(dá)則明顯降低。提示ATPR可能通過(guò)調(diào)節(jié)抑癌基因PTEN的表達(dá)，參與調(diào)節(jié)Akt的磷酸化和cyclinD表達(dá)發(fā)揮其抑制增殖和誘導(dǎo)分化作用。

綜上所述，ATPR可明顯抑制YAC-1細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其分化程度增高，其機(jī)制可能與結(jié)合RARα受體，繼而調(diào)控PTEN/PI3K/Akt通路及cyclinD表達(dá)有關(guān)。

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