EBV陽性淋巴瘤組織中EBNA1基因多態(tài)性研究

車奎 王笑峰 王云 邢曉明 羅兵

1.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物教研室,山東 青島266021；

2.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，山東 青島 266003

EBV與多種人類腫瘤的發(fā)生有關(guān)，如伯基特淋巴瘤(Burkitt's lymphoma，BL)、霍奇金病(Hodgkin's disease，HD)、鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)以及胃癌 等［1］。EBV潛伏感染和細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力被廣泛認(rèn)為是其致癌的基礎(chǔ)，目前已知EBV多種潛伏期基因編碼產(chǎn)物可引起細(xì)胞轉(zhuǎn)化，其中核抗原家族基因(EBNAs)編碼產(chǎn)物中的EBNA1是唯一在所有EBV相關(guān)腫瘤中均表達(dá)的蛋白，當(dāng)病毒潛伏感染時(shí)，其在基因組的維持、復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮重要作用［2］。EBNA1重復(fù)序列可通過順式作用方式抑制抗原遞呈細(xì)胞對(duì)自身的加工處理，使CTL不能識(shí)別自身免疫表位從而逃避機(jī)體免疫應(yīng)答［3］。EBNA1由N端(AA 1-89)、甘氨酸和丙氨酸重復(fù)序列(AA 90-327)以及C端(AA 328-641)組成，對(duì)EBNA1基因變異的分析多集中在C端。Bhatia等［4］和Gutiérrez等［5］根據(jù)突變熱點(diǎn)AA487的變化及AA466-527之間的變異，將EBNA1基因分為P-ala、P-thr、V-val、V-leu和V-pro 5種亞型。本研究對(duì)EBV陽性淋巴瘤組織中EBNA1編碼基因多態(tài)性進(jìn)行了檢測(cè)和分析，旨在探討EBNA1多態(tài)性在EBV陽性淋巴瘤發(fā)生中的意義。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

332例淋巴瘤石蠟包埋組織標(biāo)本取自2009年1月—2012年12月間在青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院就診的患者，所有病例均經(jīng)病理檢查確診，其中包括結(jié)外NK/T細(xì)胞(鼻型)淋巴瘤、彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤、外周T細(xì)胞淋巴瘤以及混合細(xì)胞型淋巴瘤等。

采用原位雜交技術(shù)檢測(cè)淋巴瘤組織中EBV編碼小RNA1(EBV-encoded small RNA1，EBER1)，EBER1特異性寡核苷酸anti-sense和sense探針按參考文獻(xiàn)［6］設(shè)計(jì)，EBER1陽性者確定為EBV陽性淋巴瘤標(biāo)本。從332例淋巴瘤標(biāo)本中共鑒定選擇出EBV陽性淋巴瘤60例用于EBNA1編碼基因多態(tài)性的檢測(cè)。

1.2 DNA提取及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

采用酚、氯仿-異戊醇法常規(guī)提取EBV陽性細(xì)胞系B95-8和EBV陰性細(xì)胞系Ramos細(xì)胞DNA，QIAamp FFPE(formalin-fixation and paraffin-embedding)DNA提取試劑盒(QIAGEN GmbH，Hilden，Germany)提取石蠟包埋組織DNA。

依據(jù)B95-8序列(基因序列號(hào)：V01555.1)，應(yīng)用Primer premier 5軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增EBNA1基因的引物(表1)。EBNA1-1和EBNA1-2為第1輪外側(cè)擴(kuò)增引物，擴(kuò)增片段為843 bp，EBNA1-3和EBNA1-4為第2輪擴(kuò)增引物，擴(kuò)增片段為 745 bp。第1輪PCR反應(yīng)體系為25 μL，包括10×Buffer 2.5 μL，MgCl21.5 mmol/L，dNTPs 0.2 mmol/L，上下游引物各0.5 μmol/L，高保真Taq DNA聚合酶［購自寶生物工程 (大連)有限公司］1.0 U，DNA模板100 ng。循環(huán)條件為 94 ℃預(yù)變性5 min；然后94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。第1輪PCR產(chǎn)物經(jīng)1∶20～1∶100稀釋后取2 μL為第2輪內(nèi)側(cè)PCR模板，反應(yīng)體積為50 μL，各試劑終濃度及循環(huán)條件同第1輪擴(kuò)增，取3 μL PCR產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)。

每次PCR反應(yīng)均設(shè)水對(duì)照、陰性對(duì)照和陽性對(duì)照，陽性對(duì)照為EBV陽性細(xì)胞系B95-8 DNA，陰性對(duì)照為EBV陰性細(xì)胞系Ramos DNA。

表1 EBV潛伏期基因EBNA1序列多態(tài)性所用引物序列Tab. 1 List of primers for latent gene EBNA1

1.3 DNA序列分析

取上述第2輪PCR產(chǎn)物45 μL送北京華大基因有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序所用引物為第2輪PCR循環(huán)引物。采用Chromas軟件查看所獲序列峰圖文件，DNAStar軟件(Larsergene，version 7.0)進(jìn)行序列剪接和對(duì)比分析，并與B95-8原型株(GenBank登錄號(hào)V01555)序列及基因庫中相關(guān)序列共同進(jìn)行對(duì)比分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SAS 6.12軟件，采用行×列表χ2檢驗(yàn)及精確概率法分析淋巴瘤標(biāo)本間EBNA1變異型，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

本研究中有51例EBV陽性淋巴瘤標(biāo)本EBNA1編碼基因C-端序列(核苷酸109159-109875)多態(tài)性分析成功，其編碼產(chǎn)物為AA404-641，該段序列包含了幾乎所有以往研究中發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)［5,7-8］。綜合以往大多數(shù)研究，根據(jù)突變熱點(diǎn)AA487及AA 466-527之間的變異，并與B95-8毒株比較，將EBNA1基因分為2種原型(Prototype，包括P-ala和P-thr，P-ala即B95-8)和3種變異型(Variant，包括V-val、V-leu和V-pro)，5種亞型487位點(diǎn)的AA分別為丙氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、亮氨酸和脯氨酸［4-5］。

與標(biāo)準(zhǔn)株B95-8相比，全部51例EBV陽性淋巴瘤組織標(biāo)本中EBNA1 C端均出現(xiàn)序列變異。除P-thr變異型在其109834堿基序列后有9個(gè)核苷酸插入，其余所有突變均為單核苷酸突變(圖1)。

圖1 EBNA1 C末端基因變異Fig. 1 EBNA1 sequence variations in lymphoma

72.6%(37/51)的EBV陽性淋巴瘤屬于V-val變異類型，該變異類型包含12個(gè)共有突變，包括10個(gè)錯(cuò)義突變和2個(gè)無義突變，錯(cuò)義突變包括AA 411 E→D、418 H→L、439 A→T、487 A→V、499 D→E、502 T→N、524 T→I、528 I→V、533 L→I和594 R→K，無義突變?yōu)锳A 520密碼子CAT→CTC和553密碼子CCG→CCA。有2例EBV陽性淋巴瘤組織在共有突變位點(diǎn)存在不同突變，其中1例AA411位點(diǎn)未發(fā)生突變(L28)，另1例未檢測(cè)到AA439位點(diǎn)突變(L22)。除上述12個(gè)共有突變外，40.5%(15/37)的病例組織中還檢測(cè)到其他散在的突變位點(diǎn)。

17.7%(9/51)變異類型為P-thr型，該變異類型有13處共有突變和9個(gè)堿基插入，包括10個(gè)錯(cuò)義突變和3個(gè)無義突變，10個(gè)錯(cuò)義突變包括AA 429 V→M、476 P→Q、487 A→T、492 S→C、524 T→I、563 M→I、574 V→G、585 T→P、594 R→K和595 V→A，3個(gè)無義突變包括AA 499密碼子GAC→GAT、520 CTA→CTC和553 CCG→CCA。在其109834堿基序列后有9個(gè)堿基(ACGGAGATG)的插入是P-thr變異型的另一特征。此外病例L48在AA 479發(fā)生不同的突變，由E突變?yōu)镼。

第3種變異類型為V-leu型，3.9%(2/51)的EBV陽性淋巴瘤組織中可以檢測(cè)到該變異類型。其含有15個(gè)共有突變，3處突變(AA 471 Q→H、487 A→L和500 E→D)僅見于該變異類型，6處突變(AA 429、476、492、563、574和585)與P-thr相同，2處突變(AA 499和502)與V-val相同，另外4處突變(AA520、524、553和594)與P-thr和V-val均 相同。

3.9%(2/51)變異類型和B95-8一致，即為P-ala型。

有1例淋巴瘤組織標(biāo)本的測(cè)序峰圖在共有突變位點(diǎn)出現(xiàn)2種亞型的特征性突變，經(jīng)過反復(fù)測(cè)試，最后鑒定為混合感染。L11在突變位點(diǎn)AA 487位點(diǎn)(A→V和A→L)及其他多個(gè)共有突變位點(diǎn)存在套峰(圖2)，其是V-val和V-leu的混合型。

圖2 EBNA1不同亞型混合感染測(cè)序圖Fig. 2 Sequence analysis for multiple infection of different EBNA1 subtypes

3 討 論

本研究我們?cè)谇鄭u地區(qū)EBV相關(guān)淋巴瘤中檢測(cè)到V-val、P-thr、V-leu和P-ala等4種EBNA1亞型，其中V-val是該地區(qū)最常見的變異類型。通過對(duì)比我們前期檢測(cè)鼻咽癌、EBV相關(guān)胃癌(EBV-associated gastric carcinoma，EBVaGC)和健康人咽漱液中EBNA1基因亞型的分布情況結(jié)果顯示，V-val既是EBV陽性淋巴瘤組織中的主 要亞型，也是鼻咽癌、EBVaGC、健康人咽漱液中的主要亞 型［8］。3種EBV相關(guān)腫瘤組織中均可檢測(cè)到P-thr和V-leu亞型；且不同EBV相關(guān)腫瘤組織中EBNA1基因亞型的分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究結(jié)果證實(shí)，與我們?cè)贓BVaGC或NPC檢測(cè)到的EBNA1亞型相似，EBV陽性淋巴瘤組織中EBNA1亞型分布也與該地區(qū)健康人群中的亞型一致，提示在EBV陽性淋巴瘤等EBV相關(guān)腫瘤發(fā)生過程中不存在對(duì)某一特定EBNA1亞型毒株的選擇傾向性，即EBNA1變異亞型與EBV相關(guān)腫瘤發(fā)生無明顯相關(guān)性。值得注意的是，本組病例中有3.9%淋巴瘤(2/51)組織檢測(cè)到P-ala亞型，而我們前期未在鼻咽癌和EBVaGC患者組織中檢測(cè)到該亞型，57例健康人中有1例該亞型陽性(1.8%)，其在淋巴瘤發(fā)生中的意義有待進(jìn)一步研究［8］。

該結(jié)果與亞洲地區(qū)的相關(guān)研究結(jié)果一致，而在非洲，美洲和歐洲，EBV相關(guān)腫瘤中很少檢測(cè)到V-val亞型，P-thr、V-leu和P-ala則是常見的亞型［6-7,9-16］。P-thr和P-ala在歐洲和北美檢出率較高，而P-thr和V-leu則在非洲和南美洲檢出率較高［14］。Sandvej等［7］對(duì)中國地區(qū)3例鼻咽癌、3例霍奇金病、2例T細(xì)胞淋巴瘤以及5例健康人咽漱液標(biāo)本中EBNA1基因多態(tài)性進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)V-val和P-thr亞型的檢出率分別為76.9%(10/13)和23.1%(3/13)；而來自丹麥的11例鼻咽癌、10例霍奇金病和8例健康人咽漱液中并未檢測(cè)到V-leu亞型。Chen等［16］檢測(cè)了日本地區(qū)25例EBVaGC標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)全部標(biāo)本均為V-val型，而來自美國的17例EBVaGC標(biāo)本中，有3例為P-ala型，9例為P-thr型，4例為V-leu型，僅有1例為V-val型。Habeshaw等［9］檢測(cè)了12例來自非洲的Burkitt淋巴瘤標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)有5例為P-thr亞型，7例為V-leu亞型，未檢測(cè)到亞洲地區(qū)最為常見的V-val亞型。上述研究結(jié)果提示，EBNA1基因變異可能受地域限制，而非疾病相關(guān)。Nie等［17］對(duì)來自同一NPC患者配對(duì)癌組織和咽漱液EBV分離毒株EBNA1序列進(jìn)行了檢測(cè)分析，結(jié)果表明，同一患者不同部位(咽漱液和癌組織)EBV毒株EBNA1亞型一致，即由同一種EBV毒株感染，支持上述結(jié)論，提示EBV相關(guān)腫瘤患者咽漱液中EBNA1亞型分析對(duì)明確其癌組織中EBV毒株具有指導(dǎo) 意義。

盡管EBNA1基因變異表現(xiàn)為地域相關(guān)性，但并不能排除EBNA1氨基酸變異可能對(duì)其功能產(chǎn)生的影響。EBNA1蛋白的主要功能區(qū)域均已確定，如DNA結(jié)合-二聚化部位(AA 459-607)和轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域(AA 450-641) 等［15］。V-val、P-thr和V-leu亞型中大多數(shù)突變位點(diǎn)位于其功能區(qū)域。功能區(qū)域氨基酸的改變可影響二聚體EBNA1的形成，進(jìn)而影響其與DNA的結(jié)合［15,18-19］，有研究推測(cè)EBNA1序列變異可能影響病毒DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及EBV的致癌性和免疫逃逸［20-22］。V-val亞型AA502、524、528和594位點(diǎn)變異，P-thr亞型AA524、563、574、585、594和595位點(diǎn)變異以及V-leu亞型AA502、524、563、574、585和594位點(diǎn)變異均集中在AA501-532和AA554-598之間。鑒于EBNA1在維持病毒潛伏感染中的重要作用，深入研究EBNA1各亞型的功能對(duì)闡釋EBNA1基因變異與EBV相關(guān)疾病的關(guān)系有重要意義。

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