大腸癌中VEGF、Ki-67和MVD的檢測及其臨床意義

焦亞莉 楊麗娟 朱蕾 陳蕾 霍亞平

實(shí)體腫瘤的生長侵襲與轉(zhuǎn)移依賴于新生血管的生成。對腫瘤血管生成機(jī)制的研究，目前主要集中于VEGF家族和具有調(diào)節(jié)血管生成作用的酪氨酸激酶受體[1]。所有促血管生成因子中，VEGF在血管生成過程中起著關(guān)鍵性作用。本研究應(yīng)用免疫組化方法檢測大腸癌組織及癌旁組織中VEGF、Ki-67的表達(dá)，并探討VEGF表達(dá)與CD34計(jì)數(shù)的微血管密度（MVD）的關(guān)系，從而評價(jià)VEGF在大腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。同時(shí)觀察Ki-67在腫瘤及瘤旁組織中的表達(dá)及意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集安陽市第六人民醫(yī)院和安陽市第二人民醫(yī)院2009-2011年資料完整的60例大腸癌根治術(shù)標(biāo)本，患者術(shù)前均未經(jīng)過任何抗腫瘤治療。其中男42例，女18例，中位年齡52歲；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者33例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者27例。大腸癌按WHO（2005）分型及有/無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移進(jìn)行分組。另選取大腸癌癌旁組織20例作為對照組。

1.2 研究方法 全部標(biāo)本經(jīng)4%中性甲醛液固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，HE染色。免疫組化采用SP法。鼠抗人單克隆抗體VEGF、鼠抗人單克隆抗體CD34、鼠抗人單克隆抗體Ki-67及免疫組化試劑盒均購自福建邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。以同一條件下染色的陽性片作陽性對照，用PBS代替一抗作陰性對照。

1.3 結(jié)果判定 VEGF、CD34定位于細(xì)胞質(zhì)，以出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞。陽性細(xì)胞數(shù)>10%為（+）。CD34陽性的單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇被視為血管。先低倍鏡下全面觀察切片以選擇腫瘤內(nèi)4個(gè)血管著色最密集的區(qū)域，在200倍鏡下用網(wǎng)格狀目鏡測微尺計(jì)數(shù)染成棕色的血管數(shù)目，取4個(gè)視野的均值作為MVD值。Ki-67以腫瘤細(xì)胞核出現(xiàn)明顯的棕黃色顆粒為陽性，陽性細(xì)胞數(shù)1%～20%為（+），21%～50%為（++），>50%為（+++）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用 字2檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VEGF的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 VEGF在癌組織中的陽性表達(dá)率為76.7%（46/60），明顯高于癌旁組織中的35.0%（7/20），兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。VEGF在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的陽性表達(dá)率也不同，分別為87.9%（29/33）和63.0%（17/27），兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在癌組織中，VEGF陽性細(xì)胞彌漫并多聚集成團(tuán)。從整體看，癌旁腸組織中VEGF陽性反應(yīng)強(qiáng)度和范圍較癌組織明顯減弱。VEGF表達(dá)與癌細(xì)胞的胞質(zhì)呈彌漫顆粒狀，見圖1。

圖1 瘤組織中VEGF陽性表達(dá)（免疫組化SP法×200）

2.2 Ki-67與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 Ki-67在大腸癌組織中的陽性表達(dá)率為73.2%明顯高于癌旁腸組織的20.1%，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Ki-67陽性表達(dá)與有/無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)（P>0.05）。Ki-67表達(dá)與癌細(xì)胞的胞核見圖2。

圖2 瘤組織中Ki-67陽性表達(dá)（免疫組化SP法×200）

2.3 VEGF陽性與MVD的相關(guān)性 46例大腸癌VEGF陽性表達(dá)組的MVD值為（38.32±12.65），14例VEGF陰性表達(dá)組為（29.63±9.3），兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。CD34定位于血管內(nèi)皮細(xì)胞質(zhì)，見圖3。

圖3 微血管CD34陽性表達(dá)（免疫組化SP法×200）

3 討論

腫瘤新生血管的生成過程中，VEGF被認(rèn)為是最重要的促發(fā)因子，并與創(chuàng)傷愈合等生理性的新生血管形成有關(guān)。研究表明，VEGF具有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖，誘導(dǎo)毛細(xì)血管生芽、增加微血管通透性、促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移和抑制凋亡等多種作用[2]。VEGF-A可與VEGFR-1及VEGFR-2結(jié)合，但主要通過與VEGF-2結(jié)合發(fā)揮促血管生成作用[3]，缺氧引起細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)因子1α和2α過表達(dá)，繼而活化VEGF基因轉(zhuǎn)錄。同時(shí)突變的K-ras等癌基因、腫瘤抑制基因、一些生長因子及細(xì)胞因子等誘導(dǎo)VEGF的表達(dá)與分泌。本組研究顯示，VEGF在大腸癌中的表達(dá)顯著高于相應(yīng)癌旁組織的表達(dá)（P<0.01）；VEGF陽性表達(dá)在有/無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的大腸癌中有顯著差異（P<0.05），提示VEGF在大腸癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移過程中起重要作用。在肺癌患者組織和血漿中亦被證明VEGF表達(dá)水平顯著升高[4-5]，且分期越晚血漿VEGF水平升高越明顯。急性白血病患者血液中的VEGF含量明顯升高，初始發(fā)病者較緩解組升高有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[6]，證明VEGF含量與病情的臨床變化有關(guān)，對了解病情、判斷預(yù)后有幫助。

腫瘤的生長過程有兩個(gè)顯著階段，即從無血管的血管前期緩慢生長階段轉(zhuǎn)變?yōu)橛醒艿难芷诳焖僭鲋畴A段。隨著腫瘤性血管的增生腫瘤加速生長，血管為腫瘤生長提供營養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)證明，腫瘤在無血管時(shí)呈線性生長，在血管生長時(shí)呈指數(shù)生長[7]。目前，MVD檢測方法已成為定量分析腫瘤血管生成的金指標(biāo)。MVD是一個(gè)獨(dú)立而重要的預(yù)后因素，高M(jìn)VD提示腫瘤易發(fā)生轉(zhuǎn)移，預(yù)后不良[8]。血管亦為腫瘤轉(zhuǎn)移提供重要的途徑，有血道遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者預(yù)后往往較差。多數(shù)研究表明，VEGF的表達(dá)水平與MVD相關(guān)[9]，本組研究中VEGF陽性表達(dá)組MVD值顯著高于VEGF陰性組（P<0.05），提示VEGF在大腸癌中可誘導(dǎo)微血管形成。

增殖能力的活躍程度是惡性腫瘤的重要標(biāo)志之一，判斷腫瘤的增殖能力是鑒別腫瘤的良惡性、提示腫瘤預(yù)后的重要指標(biāo)。相較于高倍鏡下進(jìn)行核分裂計(jì)數(shù)，穩(wěn)定的腫瘤增殖標(biāo)記分子在免疫組化中的應(yīng)用被認(rèn)為是判斷腫瘤增殖能力的可靠技術(shù)。Ki-67為細(xì)胞增生指數(shù)，是目前公認(rèn)的穩(wěn)定的腫瘤增殖標(biāo)記分子[10-11]。本組研究中，Ki-67在大腸癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織（P<0.05），提示Ki-67可用于大腸癌的診斷和腫瘤發(fā)生的研究。

綜上所述，大腸癌組織中VEGF、Ki-67的表達(dá)明顯高于癌旁腸組織，且VEGF的表達(dá)與有/無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和MVD相關(guān)，表明VEGF在腫瘤血管形成、腫瘤發(fā)展、轉(zhuǎn)移中扮演重要角色。VEGF及其受體是抗血管生成靶向治療的主要靶標(biāo)，VEGF檢測對以VEGF為作用靶點(diǎn)的抗血管生成治療具有明顯的指導(dǎo)意義。

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