加味小苦辛湯對博來霉素肺纖維化小鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)、肺系數(shù)及HYP含量的影響

王 亮 曾紅蘭 周遠(yuǎn)航 董亞威 徐榮謙

（北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京100700）

加味小苦辛湯對博來霉素肺纖維化小鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)、肺系數(shù)及HYP含量的影響

王 亮 曾紅蘭 周遠(yuǎn)航 董亞威 徐榮謙*

（北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京100700）

目的 觀察加味小苦辛湯對博來霉素 （BLM）致肺纖維化小鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)及羥脯氨酸 （HYP）含量的影響。方法 將C57BL-6小鼠70只隨機(jī)分為正常組、模型組、強(qiáng)的松組、加味小苦辛低劑量組、加味小苦辛湯高劑量組5組，每組14只 （每組再隨機(jī)分2批，每批7只）。小鼠腹腔注射BLM造模。各藥物組于造模成功后第2日起每日連續(xù)給予相應(yīng)藥物。給藥第14，28日分批隨機(jī)處死小鼠。觀察4各組病理切片肺組織形態(tài)學(xué)改變，計算肺系數(shù)和肺組織HYP的含量。結(jié)果 空白組小鼠肺組織無纖維化形成；模型組肺組織可見肺泡破壞，肺泡間隔大量纖維化，肺系數(shù)值及肺組織中HYP含量較空白組顯著增高 （P＜0.01）。各治療組肺組織纖維化程度較模型組明顯減輕，且肺系數(shù)值和HYP含量較模型組顯著降低 （P＜0.01）。結(jié)論 加味小苦辛湯可顯著降低博來霉素致肺纖維化小鼠的肺泡炎程度與肺纖維化程度，并且可以抑制造模狀態(tài)下PF小鼠肺組織中HYP含量的異常增高。

肺纖維化；加味小苦辛湯；博來霉素；小鼠

肺纖維化 （PF）的病理實質(zhì)是某些病理因素誘發(fā)肺損傷持續(xù)進(jìn)行，繼而導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)代謝紊亂，肺成纖維細(xì)胞和以膠原蛋白為主的細(xì)胞外基質(zhì)成分在肺泡和間質(zhì)內(nèi)沉積及纖維組織過度修復(fù)造成肺組織結(jié)構(gòu)的紊亂［1］。本病較多見于成人，亦可在嬰幼兒及兒童中發(fā)生，最小可見于4個月嬰兒，起病多隱匿，發(fā)病＜6個月者，病程多為急性，為6個月至2歲者可為急性或慢性，為≥2歲者多為慢性，在兒童發(fā)病率較低，但近年來亦有上升趨勢［2］。

本課題是在恩師徐榮謙教授多年臨床、科研工作的基礎(chǔ)上，根據(jù)劉弼臣名老中醫(yī)辛開苦降法治療小兒間質(zhì)性肺炎的經(jīng)驗，加減化裁而成的加味小苦辛湯，具有疏邪祛痰、降氣化瘀之功。臨床已初步證實加味小苦辛湯確有改善兒童肺纖維化臨床癥狀的療效，為進(jìn)一步探討其治療博來霉素致肺纖維化小鼠的作用機(jī)制，選擇了肺系數(shù)、肺組織病理學(xué)切片HE染色、Masson染色和為膠原纖維所特有的羥脯氨酸 （HYP）的含量等指標(biāo)，來反映膠原的沉積和肺纖維化程度的改變。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級雌性C57BL／6小鼠，70只，體質(zhì)量15～17g，北京維通利華實驗動物有限公司提供，動物質(zhì)量合格證：SCXK（京）2012-0001。飼養(yǎng)于清潔級標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境中，實驗期間小鼠自由飲水、進(jìn)食。

1.1.2 藥物與試劑 博來霉素 （BLM），日本化藥株式會社制造 （生產(chǎn)批號：Y20262，進(jìn)口藥注冊證號：H20090885）。加味小苦辛湯由黃芩、黃連、干姜、半夏等組成，免煎顆粒由北京康仁堂藥業(yè)有限公司制作提供，每1g相當(dāng)于原藥材量10g。醋酸潑尼松片，河南天方藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn) （批號110630550）。羥脯氨酸測試盒由南京建成生物工程研究所提供，批號：20130423。

1.2 方法

1.2.1 分組方法 實驗動物隨機(jī)分為5組，每組14只，分別為空白對照組、模型組、強(qiáng)的松組、加味小苦辛湯高劑量組 （4.6g／kg）和加味小苦辛湯低劑量組 （1.15g／kg）。

1.2.2 造模與給藥方法 造模除空白對照組外，其余四組均按照李麗娜等［3］的方法建立模型，分別于實驗0、2、4、6、8天于腹膜腔注射BLM（40mg／kg）200μl×5次，空白對照組注入等體積生理鹽水。造模成功后第2天起，中藥高劑量組、中藥低劑量組每天用加味小苦辛湯 （劑量分別為10mg／kg／d、30mg／kg／d）灌胃一次，強(qiáng)的松組每天用醋酸潑尼松龍注射液 （6.67mg／kg／d）灌胃一次，空白對照組、模型組每天用生理鹽水 （10ml／kg）灌胃一次，直至取材日期。

1.2.3 標(biāo)本采集 于給藥后第14，28日分批處死小鼠，每次每組7只。開胸分離出雙肺，取右肺中葉置于4%甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟切片。

1.3 主要觀察指標(biāo)

1.3.1 肺系數(shù) 造模后第14、28天稱量小鼠體重、肺重，根據(jù)測量出的體重及肺重計算肺系數(shù)：肺系數(shù)=肺濕重 （mg）／體重 （kg）。

1.3.2 組織病理學(xué)觀察指標(biāo) 肺組織切片HE染色，參照Szapiel［4］等的方法確定肺泡炎的程度分為4級：無肺泡炎 （-）；輕度肺泡炎 （+），表現(xiàn)為單核細(xì)胞浸，使肺泡隔增寬，僅限于局部和近胸膜部，面積小于全肺的20%，肺泡結(jié)構(gòu)正常；中度肺泡炎 （++）：受累面積占全肺的20%～50%，近胸膜部較重；重度肺泡炎 （+++）：呈彌漫性分布，病變范圍大于50%。

肺組織切片Masson染色，參照Szapiel［4］等的方法將肺間質(zhì)纖維化分為4級：無纖維化 （-）；輕度纖維化（+）：受累范圍小于20%；中度纖維化 （++）：受累范圍占全肺的20%～50%，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂；重度肺纖維化（+++）：受累范圍大于50%，肺泡融合，肺實質(zhì)結(jié)構(gòu)紊亂。

1.3.3 HYP含量測定 采用樣本堿水解法分別檢測實驗小鼠的肺組織羥脯氨酸 （HYP）的含量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計量資料以±s）表示，用單因素方差分析及兩兩比較的q檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺系數(shù)14天和28天的比較 造模14天時，各造模組小鼠肺系數(shù)與空白組比較均顯著增加 （P＜0.01）；小苦辛湯高劑量組肺系數(shù)與強(qiáng)的松組比較有差異 （P＜0.05），與小苦辛湯低劑量組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0.05）；小苦辛湯低劑量組肺系數(shù)與強(qiáng)的松組比較有差異 （P＜0.05）。造模28天時，各給藥組小鼠肺系數(shù)與空白組、模型組比較均有顯著差異 （P＜0.01）；小苦辛湯高劑量組肺系數(shù)與強(qiáng)的松組比較有差異 （P＜0.05）；小苦辛湯低劑量組肺系數(shù)與強(qiáng)的松組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0.05），與小苦辛湯高劑量組比較有差異 （P＜0.05）。具體結(jié)果見表1。

表1 各組肺系數(shù)值 （x±s）

2.2 肺組織病理形態(tài)學(xué)影響的比較 見表2。

表2 五組小鼠14、28天肺泡炎和肺纖維化程度分級比較

2.3 肺組織中羥脯氨酸14天和28天含量的比較 造模14天時，各給藥組小鼠肺組織HYP含量與空白組、模型組比較均有顯著差異 （P＜0.01）；小苦辛湯高劑量組肺組織HYP含量與強(qiáng)的松組比較有顯著差異（P＜0.01）；加味小苦辛湯低劑量組肺組織HYP含量與強(qiáng)的松組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0.05），與加味小苦辛湯高劑量組比較有差異 （P＜0.05）。造模28天時，給藥組小鼠肺組織HYP含量與空白組、模型組比較均有顯著差異 （P＜0.01）；加味小苦辛湯高劑量組肺組織HYP含量與強(qiáng)的松組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0.05）；加味小苦辛湯低劑量組肺組織HYP含量與強(qiáng)的松組比較有差異 （P＜0．05），與加味小苦辛湯高劑量組比較有顯著差異（P＜0.01）。具體結(jié)果見表3。

表3 各組小鼠肺組織HYP含量 （x±s）

3 討論

特發(fā)性肺纖維化是一種原因不明的、進(jìn)行性的、局限于肺部的以纖維化伴蜂窩狀改變?yōu)樘卣鞯募膊?，它是特發(fā)性間質(zhì)性肺炎中的常見類型。近20余年，其發(fā)病率增加，治療乏策，生存期中位數(shù)2.9年，5年生存率＜50%，幾乎與惡性腫瘤無異［5］。目前，肺纖維化確切的發(fā)病機(jī)制仍不是很清楚，西醫(yī)西藥臨床療效欠佳，主要使用皮質(zhì)激素類、免疫抑制劑和細(xì)胞毒性藥物。其中糖皮質(zhì)激素是治療PF的首選傳統(tǒng)藥物，但是長期服用糖皮質(zhì)激素引發(fā)明顯的副作用，且特異性差。

肺系數(shù)是反映肺纖維化程度、肺實變的最直觀指標(biāo)之一，其數(shù)值高低與肺質(zhì)量和體質(zhì)量關(guān)系密切。博來霉素誘導(dǎo)動物的肺間質(zhì)纖維化模型在早期以肺泡炎為主，后期以間質(zhì)纖維化改變?yōu)橹鳎?］。動物造模后，早期由于疾病狀態(tài)引起體質(zhì)量增長緩慢，有的甚至出現(xiàn)體質(zhì)量的持續(xù)下降，均成為肺系數(shù)升高的直接原因。肺系數(shù)的高低與肺質(zhì)量密切相關(guān)，從形態(tài)學(xué)分析，炎性滲出、細(xì)胞水腫、毛細(xì)血管充血等因素是肺系數(shù)升高的直接原因，諸因素均可造成肺質(zhì)量增加［7］。本實驗觀察到，小苦辛湯高劑量、低劑量和強(qiáng)的松組均可以降低小鼠肺系數(shù)，但小苦辛湯高劑量組較其余兩者效果稍為明顯。

肺纖維化是多種原因引起慢性肺疾病的共同結(jié)局，其病理改變以大量的成纖維細(xì)胞聚集、細(xì)胞外基質(zhì)沉積并伴有炎癥和損傷所致組織結(jié)構(gòu)破壞為特征［8］。肺成纖維細(xì)胞是肺內(nèi)膠原的主要合成細(xì)胞，而肺組織HYP的含量與膠原含量之間具有較確定的數(shù)量關(guān)系［9］。因此，研究肺組織HYP含量的表達(dá)變化可以反映確定肺纖維化的程度。本實驗觀察到，各模型組肺組織HYP含量均明顯高于空白組，小苦辛湯高劑量組肺組織HYP含量明顯降低，表明小苦辛湯高劑量可以抑制BLM造模狀態(tài)下肺纖維化小鼠肺組織中HYP含量。

恩師徐榮謙教授認(rèn)為兒童肺纖維化發(fā)病的內(nèi)因主要責(zé)之小兒正氣不足；外因責(zé)之于非時之感。正氣不足為本病之本，同時感受外邪，“虛”、“郁”、“痰”、“瘀”貫穿于疾病的始終，其基本病機(jī)為本虛氣郁，痰阻血瘀并存［10］。加味小苦辛湯由劉弼臣教授 “小苦辛湯”與五虎湯 （《醫(yī)宗金鑒·幼科心法要訣》）兩方加減而成，是徐榮謙教授在歷代先賢及劉弼臣教授“辛開苦降”的經(jīng)驗基礎(chǔ)上變化而來［11］。方中半夏辛溫，入脾胃肺經(jīng)，可燥濕化痰、降逆止嘔、消痞散結(jié)，《別錄》：“消心腹胸隔痰熱滿結(jié)，咳嗽上氣”；干姜辛熱，入脾胃心肺經(jīng)，可溫中散寒，溫肺化飲，《本經(jīng)》：“主胸悶咳逆上氣”，黃芩、黃連皆為苦寒之品，功可清熱燥濕、瀉火解毒，其中黃芩力偏于上焦，可用于肺熱咳嗽，正如 《珍珠囊》：“瀉肺火上逆”［12］。多年來，恩師在中醫(yī) “郁非辛不開，火非苦不降”的理論指導(dǎo)下，以辛開苦降法治療兒童肺纖維化，使頑痰得清，瘀滯的通，肺氣得宣，病情得緩，在臨床上取得了一定的療效。而本研究則通過實驗證明：加味小苦辛湯可抑制BLM造模狀態(tài)下肺纖維化小鼠肺組織中HYP含量和肺系數(shù)值的異常增高，同時可以改變其病理形態(tài)學(xué)。

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Ob s e r v e t h e In f l u e n c e o f Mo di fie d Xia o k u xin De c o c tio n o n t h e L u n g Tis s u e Mo r p h ol o g y、Lu ng Co e f ficien t an d HYP o f Pulmona r y Fib r o sis Mic e In d u c e d b y Ble omy cin

Wang Liang Zeng Honglan Zhou Yuanhang Dong Yanw eiXu Rongqian?
（Dongzhimen Hospital'Beijing University of Chinese M edicine'Beijing'100700'China）

Objective To observe the influence of Modified Xiaokuxin decoction on the lung tissue morphology，lung coefficient and HYP of pulmonary fibrosis mice induced by bleomycin（BLM）．Methods Mice were randomly divided into 5 groups：control group，model，group，prednisone group，low-dose of Modified Xiaokuxin decoction group and high-dose of Modified Xiaokuxin decoction group，n=14（each group were randomly divided into 2 batches，each batch of 7）．Mice model was made by intraperitoneal injection of BLM A5．Mice were daily administrated with corresponding drugs after the day of modeling．The mice were killed after 14 and 28 days'consecutive administration．The shape of mouse'lung tissues was observed，lung coefficient and the levels of hydroxyproline in lung tissues were measured．Results There was no pulmonary fibrosis in the control group，in the model group，a large number of alveolus damaged，alveolar septum fibrosis．numerical value of lung coefficient and the levels of HYP were significantly higher than that in the control group（P＜0.01）．In the treatment groups，lung fibrosis was siginificantly alleviated；numerical value of lung coefficient and the levels of HYP were significantly lower than in the model group（P＜0.01）．Conclusion Modified Xiaokuxin decoction has the effect of anti-inflammatory and anti-fibrosis on fibrosis mice induced by bleomycin and can inhibit the content of abnormally high levels of HYPin PF lung tissue in the state of modeling．

Pulmonary fibrosis；Modified Xiaokuxin Decoction；bleomycin；hydroxyproline；mice

doo：10.3969／j.issn.1672-2779.2014.08.098

1672-2779（2014）-08-0001-02

*通訊作者

楊 杰 本文校對：

2013-12-27）